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【摘要】 目的 探讨将人骨髓间充质干细胞(Human bone mesenchymal stem cells ,HBMCs)诱导为内皮细胞(endothelial cells,ECs)的可行性。方法 将HBMCs分离、培养后,加入诱导因子定向诱导为ECs,并对细胞进行鉴定和细胞活性检测。结果 经鉴定,HBMCs在特定环境下分化为了ECs,而且后者与人正常血管ECs的细胞活性无显著差异性。结论 以HBMCs诱导的ECs作为种子细胞,具有可行性。
【关键词】 人骨髓间充质干细胞;内皮细胞;种子细胞
Experimental study of incubating HBMCs into ECs for oriented differentiation
【Abstract】 Objective To investigate whether the method on incubating HBMCs into ECs is feasible.MethodsHBMCs were separated from human bone marrow and cultured.Then they were incubated into ECs in a special condition.The cultured cells were identified by morphological traits,the immunohistochemical method and surface markers.Results It was proved that the HBMCs was incubated into Ecs in a special condition.Conclusion the Ecs derived from HBMCs can be the ideal seeding cells to fabricate tissue engineering homologous valved conduits.
【Key words】 HBMCs; ECs;Seeding cells
1987年,在美国科学基金会年会上组织工程的概念被正式提出,即应用工程科学和生物科学的原理和方法,认识哺乳动物正常和病理组织器官的结构与功能关系,开发具有生物活性的人工替代物,以恢复维持和改善组织器官的功能。此后不久,人们便开始研究组织工程化心脏瓣膜的构建。其构建思路是,以人工合成材料或经脱细胞处理的生物瓣作为支架,在其上种植经体外培养,扩增后的自体活性细胞,并使之牢固粘附,生长,从而具有正常瓣膜的结构与功能。其实质是对自体瓣膜的克隆。因而在理论上是组织相容性好,无免疫原性,机械特性强,血动学优良且不易感染,无需抗凝的理想瓣膜。同种瓣以优良的血动学特性、低感染、无需抗凝等优点,已成为纠治许多先心病和风心病的首选材料 。但因是异体移植,瓣膜ECs所致的免疫反应会使瓣膜发生衰败和钙化而最终毁损。为改善其耐久性,人们设想在脱细胞同种瓣上再内皮化,构建同种组织工程瓣。但再内皮化的种子细胞一直是困扰构建的难题。本实验尝试利用HBMCs诱导为ECs,寻找获取理想种子细胞的可行方法。
1 材料与方法
1.1 材料 DMEM(高糖,GIBCO)、胎牛血清(TBD)、Ficoll(TBD)、青霉素(华北制药)、链霉素(华北制药)、制菌霉素(华北制药)、Trypsin(胰蛋白酶,Solarbio)、EDTA(乙二胺四乙酸,Solarbio)、VEGF(血管内皮生长因子,sigma)、bFGF(成纤维细胞生长因子,sigma)、CD31(sigma)、CD34(sigma)、Ⅷ因子相关抗原抗体(sigma)、一氧化氮(NO)放免试剂盒(武汉博士德生物有限公司)、内皮素(ET 1)放免试剂盒、流式细胞仪(Backman Coulter,Epics XLⅡ)。
1.2 方法
1.2.1 HBMCs的分离、培养 抽取人骨髓约10 ml稀释后300×g离心10 min,弃上清重悬后移入另一含10 ml1.073 g/mlFicoll的离心管中,400×g离心30 min,吸取上中层间的乳白层,稀释,400×g离心10 min,弃上清,重悬并计数后,以2×10�5/cm�2接种,加DMEM液(含10%的胎牛血清,100 μg/ml青霉素钠,100 U/ml链霉素)培养,3 d换液1次。融合达80%~90%,加0.05%Trypsin 0.02%EDTA37℃约5 min终止消化,1:3传代。第3代行CD34流式鉴定,第5代向内皮细胞诱导转化。
1.2.2 HBMCs向ECs诱导转化 第5~6代HBMCs中加入诱导培养基(DMEM液,10%胎牛血清,10ng/ml VEGF,5ng/ml bFGF,100ug/ml青霉素,100U/ml链霉素)。融合达80%~90%,加0.05%trypsin 0.02%EDTA37℃约3 min终止消化,1:3传代。第3代诱导细胞行免疫细胞化学Ⅷ因子相关抗原检测,胞浆呈棕褐色者为阳性;行CD34的流式鉴定。
1.2.3 将诱导后的第3代细胞培养上清液置于 70℃中保存,按试剂盒说明书测定其细胞分泌的NO和ET 1,并与正常人血管ECs培养上清液作对照。
1.3 统计学方法采用 SPSS 10.0统计软件处理,计量数以x±s表示,组间比较采用t检验,P
