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【摘要】目的:探讨芪棱汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠5-BrdU蛋白表达的影响。方法: 将大鼠随机分为假手术组、模型组、芪棱汤去养阴药组及芪棱汤组。采用颈内动脉线栓加环扎法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO\Reperfusion)。在再灌注后不同时间点采用免疫组化法检测5-BrdU蛋白表达。结果:芪棱汤去养阴药汤组与芪棱汤组5-BrdU蛋白表达明显多于模型组(P [1]。本研究旨在观察芪棱汤对脑缺血再灌注后5-BrdU蛋白表达的影响,以进一步阐明芪棱汤抗脑缺血再灌注损伤的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物:SD雄性大鼠126只,SPF级,体重(300±30)g,月龄4月左右。由广东省医学实验动物中心提供,合格证号:2006A010。
1.1.2 主要药品与试剂:芪棱汤精制液、芪棱汤去养阴药精制液由深圳市人民医院制剂中心提供;5-BrdU小鼠单克隆抗体购自天津灏洋生物有限公司,PowerVision二步法试剂盒及DAB显色系统购自北京中山生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组:大鼠126只用随机数字法分为以下5组:芪棱汤组、芪棱汤去养阴药汤组、模型组、假手术组(n=6),前三组每组又进一步分为缺血2h再灌注1d、3d、7d、14d、21d五个亚组,各亚组每组8只。
1.2.2给药方法:各组大鼠均于术前7d开始灌胃,每次2ml,每天2次 ,芪棱汤组给予灌服芪棱汤精制液、芪棱汤去养阴药汤组给予芪棱汤去养阴药汤精制液,其余两组予同剂量予生理盐水,每12h给药一次,直至处死。
1.2.3造模方法及成功标准:造模方法采用Zea longa[2]基础上改良的颈内动脉线栓加环扎法。大鼠清醒后出现同侧Horner征(梗塞灶同侧瞳孔缩小,眼裂变小,眼球内陷)、向对侧转圈爬行、提尾向对侧旋转、提尾倒立时对侧前肢屈曲者为造模成功。
1.2.4 动物取材及标本制作:除假手术组外,各组在再灌注的各时间点取动物用4%多聚甲醛固定,断头,以视交叉为中线取约4mm厚的脑组织,平分切成2mm厚的脑片,置于4%多聚甲醛中固定。常规石蜡包埋,切片机切片,片厚4μm。
1.3检测方法:免疫组化二步法检测5-BrdU蛋白表达。检测步骤严格按说明书进行操作。37℃烤片过夜。二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,蒸馏水浸泡待用。微波高火至中火,抗原修复10min。自然冷却至室温。蒸馏水冲洗3次,5min/次。3%H2O2/甲醇,室温孵育20min。0.01mol/L的PBS冲洗,3次,5min/次。封闭用山羊血清室温孵育20min,弃去不洗。滴加一抗,工作浓度为1∶100,37℃恒温孵育90min。0.01mol/L的PBS冲洗,3次,5min/次。滴加二抗,37℃恒温孵育30min。
1.4 图像分析:每只大鼠取相同部位的切片各3张,每张切片在镜下(×400)随机选取缺血区内5个非重叠视野,计算阳性细胞数,取均值(阳性细胞数目/400倍视野)即代表该鼠阳性细胞数,再计算各组均值与标准差。
1.5统计学处理:采用SPSS 11.0统计软件,数据用表示,计量资料采用方差分析。
2 结果
5-BrdU蛋白阳性细胞计数实验结果,见表1。
3 讨论
缺血性中风属于中医“中风”的范畴。中医学认为“脑为髓海”,脑缺血再灌注后出现的神经元的死亡和凋亡在中医学理论中认为是一个“髓减脑消,神机失用”的过程,而肾主生髓,通过滋阴补肾可以起到填精封髓的作用。深圳市人民医院蒋红玉教授依据此理论,结合多年临床经验拟用芪棱汤,使用黄芪、三棱、莪术等益气活血药的基础上重用桑椹、花粉,全方益气活血而不伤阴液,起到了填精封髓的作用,从而更加有助于脑缺血再灌注后神经功能的恢复。神经干细胞的增殖分化在中医学理论看来正是一个“生精益髓”的过程,也就是《黄帝内经》中所说的“阳化气, 阴成形”。
本研究发现,假手术组未见5-BrdU蛋白表达。在脑缺血再灌注后的1、3、7、14、21d时间点,模型组的缺血周边区均可以发现少量的5-BrdU蛋白阳性细胞,且在缺血再灌注7d时表达呈高峰;脑缺血后神经干细胞原位激活的机制尚不明了,可能与脑缺血再灌注时氧自由基增加、钙超载以及兴奋性氨基酸的释放有关,脑卒中后3~7d是分子激活和生物代谢的活跃时期,此时有丝分裂原、营养因子、细胞黏附分子及其他相关分子表达相继达到高峰,这也可能与神经干细胞的原位激活有关,尚须进一步研究。脑缺血再灌注后1d、3d时间点,芪棱汤去养阴药汤组、芪棱汤组和模型组比较, 5-BrdU蛋白阳性细胞计数差异无统计学意义,提示在脑缺血再灌注的1~3d,芪棱汤和芪棱汤去养阴药汤并不能促进5-BrdU蛋白阳性细胞的表达,中药制剂的获效可能需要一个较长的治疗过程。在脑缺血再灌注后7、14、21d时间点,芪棱汤组和模型组5-BrdU蛋白阳性细胞计数差异有统计学意义,芪棱汤组5-BrdU蛋白阳性细胞表达高于模型组;芪棱汤去养阴药汤组和模型组5-BrdU蛋白阳性细胞数目差异有统计学意义,芪棱汤去养阴药汤组5-BrdU蛋白阳性细胞表达高于模型组;芪棱汤组和芪棱汤去养阴药汤组5-BrdU蛋白阳性细胞数目差异有统计学意义,芪棱汤组5-BrdU蛋白阳性细胞表达高于芪棱汤去养阴药汤组,说明芪棱汤和芪棱汤去养阴药汤在7、14、21d时间点可以促进5-BrdU蛋白表达,而芪棱汤的效果要优于芪棱汤去养阴药汤。
本研究针对脑缺血再灌注后的“髓减脑消”用芪棱汤“填精益髓”,发现该方可以促进5-BrdU蛋白的表达,表明其可以促进神经干细胞的增殖,而部分恢复缺损的神经功能。
参考文献
[1] 赵喜连,周荣峰,蒋红玉等.芪棱汤对脑缺血再灌注后nestin蛋白表达的影响[J].中国中医急症,2008,17(1):72-74
[2] 褚晓凡,董家政,吴军等. 颈内动脉线栓与环扎建立大鼠局灶脑缺血再灌模型[J].中风与神经疾病杂志,2000,17(3):152-154
作者单位:518108 广东省深圳市宝安区石岩医院�1
518020 广东省深圳市人民医院 �2
