【www.zhangdahai.com--组织人事公文】
【摘 要】 利用PCR技术, 从大肠杆菌中扩增出不含信号肽序列的K88基因和LTB基因片段，将其克隆到表达载体pQE-30中, 构建了原核表达载体pQE30-K88-LTB，并转入大肠杆菌中。诱导后，蛋白电泳分析结果显示，目的蛋白获得高效表达。经蛋白印记检测表明，表达的蛋白能与大肠杆菌阳性血清和重组蛋白抗血清发生特异性反应。
【关键词】 K88；LTB；表达
肠毒素大肠杆菌是引起世界上发展中国家婴幼儿及到这些国家旅游者腹泻的主要致病菌，危害严重。现已知大肠杆菌定居因子和肠毒素与疾病密切相关，定居因子是大肠杆菌细胞表面菌毛，肠毒素是大肠杆菌产生的毒性分泌蛋白，有不耐热肠毒素和耐热肠毒素两种。当病原菌感染宿主后，大肠杆菌首先通过定居因子粘附到小肠粘膜上皮细胞刷状缘受体上，抵抗住肠道蠕动与肠内分泌物清洗，维持ETEC在肠道内生长繁殖。然后释放出肠毒素，与小肠细胞膜上的特异受体结合，引发细胞内水、电解质失衡，造成细胞吸收障碍，产生水样、脱水性腹泻。定居因子与小肠粘膜粘附和肠毒素致毒是大肠杆菌腹泻不可或缺的两个必要条件。
我们在前人研究工作基础上，构建了一种能表达大肠杆菌pQE30-K88-LTB融合蛋白的基因工程菌株，并计划把它转化到乳酸菌中进行表达，研制大肠杆菌基因工程活疫苗，利用乳酸菌作为载体，经口服途径进入胃肠道，将大肠杆菌基因表达在活乳酸菌的表面，刺激机体的胃肠道产生粘膜免疫和体液免疫，以期达到增加疫苗的安全性，提高疫苗免疫效果，为更有效地预防婴幼儿和旅行者腹泻，提供一种新型基因工程菌苗的候选菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒模板菌株和感受态细胞BL21、表达载体pQE-30，由本实验室保存；克隆载体pMD18-T, 购自大连宝生物工程有限公司。
1.1.2 主要试剂、酶类限制性内切酶和其它工具酶为MBI公司产品； 弗氏完全(或不完全) 佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体为Sigma公司产品；其他试剂为国产分析纯。
1.1.3 引物设计 根据已发表的K88和LTB基因设计两对引物，序列如下：
K88-上游引物：GGATCCTTTGGTAATGTATTGAATG
K88-下游引物：GGTACCTTACTCTTTGAATCTGTC
LTB-上游引物：GGTACCCTCCCCAGACTATTACAGAACTAT
LTB-下游引物：AAGCTTGTTTTTCATACTGATTGCCGC
1.1.4 测序DNA序列由上海生工生物技术服务有限公司测定。
1.2 方法
1.2.1 PCR 扩增
1.2.1.1 DNA模板的制备 用移液器无菌取少量大肠杆菌接种到5ml液体LB培养基中，过夜培养后，采用煮沸法制备模板DNA。
1.2.1.2 K88和LTB基因的PCR扩增 PCR反应体系为1μLDNA模板、2μLdNTP、2.5μL PCR缓冲液、上下游引物各1μL、Taq酶0.25μL，混和后加水至总量为25μL；反应的循环参数为94℃预变性10min；94℃变性1min；56℃退火1min；72℃延伸1 min，进行30个循环；72℃继续延伸10min。
1.2.2 pQE30-K88-LTB表达载体的构建质粒的提取和纯化、酶切反应、DNA片段的分离纯化、连接、质粒转化、菌株诱导表达等，参见分子克隆实验指南的方法。
1.2.3 蛋白电泳分析参见分子克隆实验指南。
1.2.4 重组pQE30-K88菌毛蛋白的纯化 纯化过程按照Qiagen蛋白质纯化试剂盒说明书进行。
1.2.5 重组蛋白抗血清的制备将含有纯化重组蛋白的缓冲液与弗氏完全(或不完全) 佐剂按照1�1充分混匀乳化好后, 按照100μg/kg抗原的剂量免疫新西兰大白兔。首次免疫2周后, 隔周加强免疫。末次免疫后一周, 颈动脉放血, 于4℃冰箱保存, 析出的透明、淡黄色上清液即为K88-LTB融合蛋白的抗血清。
1.2.6 蛋白质印迹分析 分别以K88、LTB单因子血清和自制的重组K88-LTB融合蛋白抗血清作第一抗体, 按1�300 稀释；羊抗鼠抗体作第二抗体,按1�5 000 稀释使用。
2 结果
2.1 K88ac基因的扩增结果
图1: K88、LTB基因PCR扩增结果
1.3 DNA Marker DL2000; 2. K88基因的PCR产物;
4. LTB基因的PCR产物
2.3 重组K88-LTB 融合蛋白基因的表达 将鉴定正确重组质粒pQE30-K88-LTB导入到宿主菌中，诱导处理后, 进行SDS-PAGE分析。结果表明(图2)，重组K88菌毛蛋白亚基基因获得高效表达。
图2 SDS-PAGE电泳结果
1. 加IPTG诱导3h的重组菌;
2. 加IPTG诱导6h的重组菌;
3. 空载体; 4. 蛋白 Marker
2.4重组K88-LTB菌毛蛋白抗血清的免疫学检测自制的融合蛋白抗血清和K88、LTB单因子血清做一抗分别对重组工程菌株的总蛋白进行蛋白印记检测。结果表明(图3),均能检测到大小约
为31kDa的阳性反应条带。
图3 融合蛋白的蛋白印记结果
1,6.蛋白Marker; 2. 阴性血清对照; 3. K88单因子血清为一抗的蛋白印记结果;
4. 重组菌抗血清为一抗的蛋白印记结果; 5.LTB单因子血清为一抗的蛋白印记结果
3 讨论
本项研究通过DNA 重组技术对大肠杆菌的主要粘附因子K88基因进行体外改造，去除了信号肽序列，扩增了K88和LTB基因，构建了重组表达质粒pQE30-K88-LTB，经IPTG诱导后，利用pQE-30载体本身的启动子实现了在大肠杆菌内的高效表达。经蛋白印记检测表明，表达的抗原蛋白能与大肠杆菌阳性血清和重组蛋白抗血清发生特异性反应。证明表达的融合蛋白具有免疫原性，并进一步为构建以乳酸菌为载体的口服基因工程疫苗的研究提供了重要的参考依据。
