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摘 要：目的：观察合成冰片的致突变性。方法：采用Ames试验、细胞染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。结果：合成冰片在0.4～250μg/皿范围内(+/-S9mix)，Ames试验结果阴性。24h的CHL细胞IC50为85.74μg・ml-1。80、40、20、10、5(μg・ml-1)下，染色体畸变率均0.05。结论：合成冰片未显示致突变性。
关键词：合成冰片；致突变性；Ames试验；CA试验；MN试验
中图分类号：R282；R114 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-044-03
冰片为常用芳香开窍中药，按来源不同而有天然冰片、合成冰片之分，天然冰片多为龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品；合成冰片是以樟脑、松节油为主要原料经化学方法合成。因龙脑香树在我国没有资源分布，价格昂贵，故目前大多使用合成冰片替代天然冰片[1]。本文参照中华人民共和国卫生部药政管理局颁发的《新药(中药)临床前研究指导原则》的有关规定，采用鼠伤寒沙门氏菌诱变性试验(Ames试验)、细胞染色体畸变(CA)试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核(MN)试验检测其致突变作用。
1 材料与方法
1.1 受试物
合成冰片由云南三木(集团)有限公司思茅香料厂提供，滇卫药准字：(90)56-001，研细粉过140目筛，以二甲基亚砜(DMSO)或羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制。
1.1.2 试验菌株
采用TA97、TA98、TAl00和TAl02四株标准菌株(北京军事医学科学院惠赠)。经鉴定菌株遗传特性均符合试验要求。
1.1.3 试验细胞株
中国仓鼠肺成纤维细胞由北京军事医学科学院毒物药物研究所惠赠，经细胞株染色体核型鉴定合格。用pH7.2、含10%胎牛血清的RPMI-l640培养液(GIBCO-BRL公司)，37℃、5%CO2条件下培养。
1.1.4 试验动物
ICR小鼠(SPF级)，18～22g，雌雄各半。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK11-00-0008。
1.2 方法
1.2.1 Ames试验
培养基、增菌培养、肝脏微粒体酶混合液(S9mix)的组成均按Maron修订方法进行。采用平皿掺入法，合成冰片受试浓度设置为250、50、10、2和0.4(μg/皿)。同时设溶剂对照、空白(自发回变)对照、阳性诱变剂对照[敌克松(50.0μg/皿)作用于四种菌株(-S9)，活化试验中2-氨基芴(20.0μg/皿)作用于TA97、TA98、TAl00，1、8-二羟基蒽醌(50.0μg/皿)作用于TAl02]，按规定重复试验。用SPSS10.0统计软件计算回复突变菌落数平均值(χ±s)。如在某一个测试浓度诱发的回复突变菌落数为自发回变的2倍或2倍以上，判为阳性反应[2]。
1.2.2 染色体畸变试验
根据细胞毒性测定结果，合成冰片在2～125(μg・ml-1)间IC50为85.74μg・ml-1(y=0.04271+0.00216x，r=0.9523)。故设80、40、20、10、5(μg・ml-1)5个剂量，阴性对照为DMSO，阳性MMC 0.25μg・ml-1(-S9)、CP 20μg・ml-1(+S9)，及空白对照组(+/-S9)。每组3个平行样。为避免S9mix处理时间过长对细胞的影响，选择24h收获细胞，收获前6～10h加入秋水仙碱(终浓度0.2μg・ml-1)，制备染色体标本。每个标本观察100个中期分裂相细胞，统计染色体畸变率，记录畸变类型：数目异常(P)、缺失(D)、碎片和粉碎化(F)、单体断裂(B)、环状染色体(R)、染色单体易位(T)。判断标准：细胞畸变率10%为(+)[3，4]。
1.2.3 微核试验
合成冰片用1%CMC―Na水溶液稀释至0.2g生药/ml；以4.881、3.661、2.746、2.060、1.544和1.158(g/kg)ig小鼠；ICR小鼠按体重随机分组，共设6组，每组10只(雌雄各半)。并根据预试验结果确定剂距。使用《NDST新药统计程序》软件用Bliss法计算LD50及95%可信限[5]。
据预试验结果选择给药24h作为制备骨髓标本时相点。以LD50的1/2、1/4、1/8设置剂量。阴性对照(等体积1% CMC-Na)；阳性对照(0.06g/kg・bw腹腔注射环磷酰胺)。采用一次染毒方法[4]，制备骨髓涂片后每个动物标本随机镜检1000个嗜多染红细胞(PCE)，计算微核发生率。同时注意区分成熟红细胞(NCE)与PCE[5]，如图：
图1 小鼠骨髓涂片(40×)
图2 嗜多染红细胞中的微核(100×)
图1所示：a为NCE、b为PCE。图2所示：箭头所示为PCE中的微核。以正常小鼠微核率最大值均小于4‰作为判断结果的参考值。
2 结果
2.1 Ames试验
如表1所示，合成冰片5个剂量组(+/-S9mix)均为阴性。
2.2 CA试验
合成冰片剂量组染色体分散良好，畸变染色体少见(图3)。
图3 合成冰片(80μg・ml-1)作用后的CHL细胞(100×)
而MMC和CP对照组畸变染色体多见(图4、5)。
图4 MMC(0.25μg・ml-1)作用后的CHL细胞(100×)
图5 CP(20μg・ml-1)作用后的CHL细胞(100×)
表2显示除阳性对照组外，其他各组的染色体畸变率均50值为2.983(2.538~3.507)g/kg。各剂量组PCE/NCE在正常值范围。由表3显示，各剂量组微核发生频率雌鼠与雄鼠比较差异无显著性，P>0.05；合成冰片微核率与阴性对照组比较差异无显著性，P>0.05。提示微核试验结果阴性。
3 讨论
近年中药安全性问题越来越受到重视，而有关中药的短期遗传毒性测试研究报道日渐增多。冰片是复方丹参滴丸、速效救心丸等年销售额过亿的中成药大品种的主要成份，在临床和制药行业颇受关注，对其安全性进行深入研究有较重要意义。因此本研究选用了Ames试验、CA试验、MN试验这三个测试系统来检测合成冰片的诱变性，这也是目前中国和欧共体制定的遗传毒性评价方案中的标准组合试验[6]。本试验组合的三个测试系统结果均一致，提示合成冰片无致突变性，对遗传物质无损伤作用。为合成冰片的应用提供遗传毒理安全性实验数据。
参考文献：
[1] 李毓敬.天然龙脑的植物资源[J].中药材，1992；15(6)：9-11.
[2] Maron D M，Ames B.N.Revised methodrs for the salmonella mutagenicity test[J].Mutation Research，1983，113：173-215.
[3] 袁伯俊，王治乔.新药临床前安全性评价与实践(第一版)[M].北京：军事医学科学出版社，1997.
[4] 黄幸纾，陈星若，丁辰主编.环境化学物致突变、致畸、致癌试验方法(第一版)[M].杭州：浙江科技出版社，1985：89-102.
[5] 徐淑云.药理实验方法学[M].第二版.北京：人民卫生出版社.1991.
[6] 张天宝.新药遗传毒性评价方法的研究现状和发展趋势[J].癌变・畸变・突变，2002，14(4)：243-246.
(责任编辑：陈涌涛)
Study on The Mutagenicity of Synthetic Borneol
LIU Yang，JIANG Min，ZHANG Han，QU Cai-qin，LI Yi-lan，HU Li-min
Abstract：Objective：To evaluate the mutagenicity of Synthetic Borneol.Methods：The Ames test，the CA test and MN test were used.Results：Ames test at 5 doses(0.4~250g/plate) was negative.The IC50 was 85.74μg・ml-1(24h，r>0.9).The proportion of chromosomal aberration was less than 5% at 80、40、20、10、5(μg・ml-1)(+/-S9mix).In MN test no significant difference were observed at the dose of 0.373、0.746、1.492(g/kg・bw)in micronuclei rates between the controlled and all groups(P>0.05).Conclusion：Synthetic Borneol have no mutagenic action though our study.
Key words：Synthetic Borneol；Mutagenicity；Ames Test；CA Test；MN Test
