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摘 要：随着疫苗研究的飞速发展，如重组DNA疫苗、合成肽段疫苗等，免疫佐剂的研究越来越受到人们的关注。佐剂可以导致快速而强烈的免疫反应。分析了常用佐剂的应用及其各自的优缺点，并综述了两种新型的免疫佐剂的研究进展。
关键词：免疫；佐剂；疫苗
中图分类号：R392.5 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-025-03
早在70年前，免疫佐剂就被广泛地应用于生产和研究。佐剂与特异性免疫原本无关，但可非特异性地通过物理的或化学的方式与特异性免疫反应物质结合，从而诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时能减少抗原的用量，节约成本。随着疫苗研究的不断深入，特别是分子生物学技术的迅速发展，研制出的新型基因工程疫苗纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性相对较差，难以产生有效的免疫应答，需要佐剂来增强其免疫原性或宿主对抗原的保护性应答。本文就常用佐剂以及最近深入研究、比较的两种免疫佐剂的研究进展进行了综述。
1 常用免疫佐剂
1.1 铝盐佐剂
铝盐是一种含有Al3+的无机盐，主要有Al(OH)3、AlPO4等。铝盐佐剂的应用非常广泛，是现在唯一被FDA批准的人、兽均可应用的佐剂。铝盐与抗原结合形成抗原贮存库，使抗原得以缓慢稳定地释放。铝盐的应用已有八十年的历史，实践证明是一种有效的诱导免疫反应的佐剂，而且氢氧化铝成本低廉，使用方便、无毒，是胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原的良好免疫佐剂。但它也存在明显的缺陷，主要的不足之处是铝盐佐剂仅能诱导、激发体液免疫，对由胞内病毒如人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒(HSV)等引起的病毒性疾病无法产生有效的细胞免疫[1]。
1.2 氟氏佐剂
氟氏佐剂分为氟氏完全佐剂(FCA)和氟氏不完全佐剂(FIA)两种。FCA是在FIA的基础上加一定量灭活的分枝杆菌而成的，是Th1亚型细胞强有力的激活剂。FCA既能刺激体液免疫，还是细胞免疫的强刺激剂。FIA则仅刺激体液免疫。但弗氏佐剂在使用中可引起慢性肉芽肿和经久不愈的溃疡，造成严重的组织损伤。Wagland等[2]实验证明：在用FCA作为佐剂为猪做免疫时，尽管产生了较高的抗体滴度，却降低了免疫效果。弗氏佐剂的代表性替代品有乳胶类佐剂Ribi和Titer Max，采用了可代谢和无毒的鲨烯作为油剂，以减轻炎症反应。但其实验效果并不稳定[3]。除少数兽用疫苗如口蹄疫疫苗使用FIA外，很少用于动物免疫，更不能用于临床医学。
1.3 脂质体佐剂
脂质体是一层或多层脂质双分子膜以同心圆形式包封而成，兼具佐剂和载体功能，类似细胞膜的微球体。脂质体能将抗原传递给合适的免疫细胞，具有靶向作用。脂质体无毒、无免疫原性，且在体内可降解，是一种较良好的佐剂。在细菌类、病毒类、寄生虫类以及肿瘤类脂质体疫苗的开发中有许多相关报道证实了它的有效性。由N’，N’―二甲基乙二胺基氨甲酰基胆固醇(DC-chol)制备成的正电荷脂质体作为基因转移的载体而被批准用于基因治疗的临床研究。这种正电荷脂质体的表面吸附带负电荷的蛋白质疫苗，增强了疫苗的免疫原性，且其成份简单，制备方便，结构稳定，安全无毒，可望在不久的将来成为继铝佐剂后又一种被批准用于人类疫苗的新型佐剂[4]。易学瑞等[5]用DC-chol制备粒径为50~300nm的正电荷纳米脂质体，作为乙肝疫苗的佐剂，免疫小鼠后进行血清中特异型抗体IgG1、IgG2、脾细胞产生的细胞因子的测定。结果表明，该制剂诱导的特异性抗体以IgG2为主，能诱导高水平的Th1类的细胞因子IL-2、IFN-γ，表明纳米正电荷脂质体将能顺应疫苗研究的发展方向，有助于提高蛋白质疫苗和基因疫苗的细胞免疫效应。
1.4 免疫刺激复合物(ISCOM)
ISCOM是由抗原、皂苷、胆固醇、磷脂组成的疏水性笼状结构。该结构使抗原颗粒化，比可溶性的抗原更易被APC吞噬，能同时活化Th细胞、CTL细胞、B细胞。既能激发细胞免疫，又可激发体液免疫，可产生全面的免疫应答。用ISCOM技术制备的各种兽用细菌、病毒、寄生虫疫苗已有大量研究。Furrie E等通过给小鼠口饲含卵蛋白(OVA)的ISCOM发现，小鼠肠相关淋巴细胞组织(肠系膜淋巴结MLN和集合淋巴结PP)有炎性细胞募集，即活化的F4/80+巨噬细胞、活化的树突细胞、CD4+T细胞及B220+B淋巴细胞数均明显升高，进一步实验证明，实验组小鼠血清OVA的吸收速度加快，峰值提早，提示ISCOM可通过对抗原摄取和局部辅助细胞的联合影响来增强肠道抗原的免疫原性，具有开发为粘膜佐剂的前景。
1.5 细胞因子
细胞因子是由免疫系统分泌产生的小分子多肽。是用于防御外来微生物的主要免疫介导因子和效应物质。多种细胞因子都具有免疫佐剂的作用。将编码细胞因子的质粒与DNA疫苗共注射时，在不同程度上增强DNA疫苗的免疫效果，并可引导免疫向有利的方向转变。目前用于诱导Th1免疫应答的细胞因子主要是IFN-γ、IL-2、IL-12等，而诱导Th2免疫应答的细胞因子则是IL-4、IL-6、IL-10等，其中以IL-12的研究最为引人注目。IL-12又称为细胞毒性T细胞成熟因子和自然杀伤细胞刺激因子。可作用于NK细胞和T淋巴细胞，是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁。IL-12能强有力地刺激NK细胞，诱导产生IFN-γ，还可刺激原初CD4+T细胞分化为Th1亚群，调节Th1/Th2型应答的平衡，有助于Th1分化优势。同时IL-12还可刺激CD8+T细胞分化为成熟细胞[6]。在寄生虫，特别是胞内寄生虫的感染中，IL-12具有强大的免疫保护作用，已经在利什曼原虫、疟原虫、弓形虫和血吸虫感染的试验中获取得了一定的效果。
2 两种新型佐剂的开发
2.1 CpG佐剂
CpG是一类以CpG二核苷酸为核心的未甲基化的特殊的DNA序列。CpG ODN作为佐剂，可明显促进Thl型免疫应答的产生。其与不完全弗氏佐剂联合应用时，其效应甚至强于完全弗氏佐剂。即使与Th2型佐剂如氢氧化铝合用亦可明显促进免疫应答的产生，且Thl型应答明显强于Th2型应答。CpG ODN能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞等，间接激活T细胞、NK细胞，诱导以Thl型为主的免疫应答，是一种高效低毒的免疫佐剂，在基因疫苗、免疫缺陷性疾病、肿瘤、感染性疾病及过敏性疾病的治疗中有着强大的潜在应用价值。
最初得到的CpG来源于微生物细菌，而且只有非脊椎动物的DNA具有上述生物活性，脊椎动物和植物的则没有。进一步的研究表明，在细胞DNA中，CpG基序出现的频率为1/16，且是非甲基化的，而在脊椎动物基因组中则以1/50~1/60的低频率表达，其中80%左右的胞嘧啶被甲基化。如果将细菌CpG DNA中的胞嘧啶甲基化，则会失去免疫刺激效应。
脊椎动物免疫系统识别细菌CpG DNA的过程认为比较经典的是NF-κB途径。天然免疫系统细胞表面有一种模型识别受体(PRRS)，该受体能与存在于微生物细胞的分子模型特异性结合，该类分子模型称为病原体相关分子模型(PAMPs)。CpG DNA作为一种PAMP，与细胞膜上负责细胞信号转导的Toll样受体9(TLR-9)特异性结合，在另一种接头蛋白即髓样分化标志物88(MyD88)的参与下，将胞外信号传导至胞内，与胞内靶物质具有丝/苏蛋白激酶活性的IL-1受体相关激酶(IRAK)作用，使IRAK磷酸化，继而与肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6相结合，通过TRAF6使IRAK连接于NF-κB诱导激酶，使NF-κB通路活化，诱导某些基因的特异表达[7]。
这种CpG-DNA/TLR9/MyD88/NF-κB的作用途径一直被认为是CpG作用的主导途径，但Spies[8]等的实验却否定了这一假设。他们将CpG基序插入到质粒骨架区观察表达OVA的质粒的免疫原性。实验结果表明，在体内反复多次的质粒免疫后，OVA特异性CTL的增殖反应在DC TLR9+和TLR9-或MyD88-的小鼠中都一样。这一结果提示，CpG-DNA与免疫细胞的作用方式除了CpG-DNA/TLR9途径外，还可能存在其他模式。
由于CpG DNA的免疫刺激作用存在种属特异性。国内外许多研究者致力于筛选对不同动物最佳免疫刺激性的CpG ODN作为免疫佐剂。景志忠等[9]通过筛选人工合成多种经硫代修饰的CpG ODN序列，对兔、猪、鼠体进行了与铝胶、206佐剂、蜂胶佐剂的配伍和比较实验，结果显示，CpG ODN与铝胶联合各组比相应单一佐剂组的抗体效价增加显著，其中，CpG2的优越性更明显。不仅具有强烈刺激体液免疫的功能，而且强烈刺激细胞免疫。李光富等[10]设计合成了38种CpG ODN，经过多次实验筛选出了一种改进的CpG ODN18264，与佐剂配合rSj28GST-TrX抗原免疫小鼠，结果表明，不仅能有效提高抗rSj28GST-TrX抗体的水平，而且能使IgG2a：IgG1的比值显著增高，有效地调节免疫应答类型向Th1型转换。
CpG ODN通过硫代化处理克服了在体内易降解的缺点，又因其可激发强烈的细胞免疫，这样对一些由胞内病毒引起的病毒性疾病的免疫显得尤为重要。一些不能与铝剂混合的减毒活疫苗或多价疫苗则可用CpG ODN增强免疫原性，同时证明CpG ODN对口服抗原也具佐剂效应。由于CpG ODN在研究过程中发现不仅有种属的特异性，又因抗原的不同而产生有差异的调节效应，给其研究带来了很多麻烦[11]，但由于其明显的优点及在免疫治疗、疾病预防等方面前景广阔，许多研究者正致力于将其开发为一种新型免疫制剂。
2.2 粘膜免疫佐剂CT和LT
粘膜免疫在防御病毒、细菌等病原体引起的肠道及呼吸道感染中起主要作用，是机体免疫防御的第一道防线。而粘膜表面特殊的理化性质，减弱了粘膜免疫强度，甚至导致免疫耐受。粘膜免疫佐剂活性是CT和LT的重要生物学活性之一。CT是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素，由一个毒性A亚基CTA和五个完全相同的B亚基CTB组成，A亚基合成后裂解为CTA1和CTA2，以二硫键连接。其中CTA1具有ADP-核糖基转移酶活性，与CT的佐剂作用密切相关。LT是由大肠杆菌产毒株合成的一种不耐热肠毒素，结构与CT类似，也具有特有的ADP-核糖基化活性。LTB和CTB与表达于细胞表面的GMI神经节苷脂及其它受体有极高的亲和力，在其免疫原性和佐剂作用中扮着重要角色。
CT和LT不论是经口服还是鼻腔接种途径给予，对于特定的蛋白抗原都是非常有效的佐剂。CT是良好的粘膜免疫原，作为佐剂，能提高对多种口服天然抗原的局部粘膜免疫力，特别是在于胃肠道粘膜免疫有极强的免疫原性，可大大提高血液和粘膜IgA的产量。而且LT诱导的粘膜分泌性抗体应答并不限于抗原沉积部位，在其他粘膜效应部位也有同样的应答发生，符合共同粘膜免疫系统(C MIS)的理论。CT和LT的作用机理目前尚不太清楚。研究证明，CT可诱导DC成熟，能提高巨噬细胞和B细胞表面的B7-1和B7-2的表达，增强其协同处理的蛋白抗原的CD4+Th2应答，引起Th1向Th2转化，而对CD8+T细胞有强烈的抑制作用，通过TH2型应答产生的IgA、IgG、IgM等实现粘膜免疫[12][13]。
CT和LT作为口服粘膜免疫佐剂有很好的效果，但其毒性作用严重地限制了其应用。研究者追求的应该是无毒副作用、高效广谱的佐剂。随着分子生物学的发展，给CT和LT的应用带来了新的机遇，使其成为佐剂开发的新热点。通过基因工程的方法，对其具有毒性的亚单位通过单个氨基酸的突变可以保留佐剂的性能而减少毒性。当前的研究主要是构建减毒的突变体和嵌合体，使其具有一定的酶活性而获得足够的佐剂活性，同时，酶活性又不至于对人产生可见的毒副作用。Boyaka等[14]报道，由突变的CTA(mCTA)LTB构成的嵌合体mCTA/LTB作为佐剂经鼻腔接种后，比其它毒素来源的佐剂产生抗CTB的IgE抗体低得多，具有两种外毒素的优点，是将来用于人类粘膜免疫佐剂的具有优势的侯选者。
3 展望
近年来，免疫佐剂的发展非常快速，人们通过各种途径力求寻找一种尽可能达到最大刺激作用和最小毒副作用的佐剂。佐剂的联合使用及发挥其协同作用显得尤为重要。Mccluskie等[15]联合使用LT和CpG ODN作为HBsAg的佐剂免疫小鼠，从特异性系统体液免疫、粘膜体液免疫、T细胞介导的免疫及细胞因子等多方面进行评价，证实了CpG ODN与LTB的协同作用，推测CpG ODN联合保留部分酶促反应的LT重组体可能取得最佳免疫放大作用。
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(责任编辑：陈涌涛)
