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摘 要:目的:以冠心病患者外周血单核细胞为研究对象,观察氟伐他汀对体外培养的冠心病患者外周血单核细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)表达的影响。方法:于冠脉造影时无菌采集血液标本,肝素抗凝,密度梯度离心法分离患者外周血单核细胞,按作用时间与浓度分组,分别与10.0μmol/L氟伐他汀作用0h、6h、12h、24h,以及0、1.0、10、100μmol/L浓度的氟伐他汀作用24h。提取各组细胞总RNA,逆转录多聚酶链反应检测ABCA1 mRNA的表达。结果:与对照组比较,10.0μmol/L氟伐他汀作用于单核细胞6h、12h、24h以及不同浓度的氟伐他汀与单核细胞孵育24h均不能增强单核细胞ABCA1 mRNA (P>0.05)。结论:氟伐他汀不能增强冠心病患者单核细胞ABCA1的表达。
关键词:单核细胞;氟伐他汀;三磷酸腺苷结合盒转运体A1;动脉粥样硬化
中图分类号:R541.1文献标识码:A文章编号:1673-2197(2009)06-0012-03
研究表明高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)通过参与胆固醇逆转运(RCT)发挥抗动脉粥样硬化作用,与冠心病发病危险呈独立的负相关[1]。在RCT过程中,HDL及其载脂蛋白介导外周组织过剩的胆固醇转运至肝脏经胆汁排泄。ABCA1功能缺陷可导致Tangier病(TD)和家族性HDL缺乏症(FHD),主要表现为血浆HDL浓度显著降低和早发心血管疾病[2]。目前认为ABCA1的主要作用是将细胞内胆固醇和磷脂转运至细胞膜外并与载脂蛋白A1结合,形成新生HDL颗粒,启动RCT过程。由此可见,ABCA1在RCT和HDL生成的起始步骤中起重要作用[3]。他汀类药物在冠心病的防治中占有重要地位。不仅能通过抑制三羟基三甲基戊二酰辅酶A还原酶阻断羟甲戊酸(MVA)途径以及增加肝脏LDL受体表达而降低血浆LDL-胆固醇的浓度,还能升高HDL,目前对其升高HDL的机理尚未阐明。为探讨他汀类药物是否能通过ABCA1途径升高HDL水平,我们检测了他汀类药物氟伐他汀对冠心病患者外周血单核细胞ABCA1表达的影响。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);TRIzol RNA 提取试剂(Invitrogen 公司);逆转录―多聚酶链反应试剂盒(Promega 公司);高保真PCR扩增试剂盒(上海生物工程公司);羊抗人ABCA1―抗(santa cruz 公司),辣根过氧化物酶标记兔抗羊二抗(武汉博士德公司);氟伐他汀原药粉(cayman公司)。其它试剂与材料均为进口或国产分析纯。ABCA1、GAPDH 引物均由上海旭冠生物科技有限公司合成。
1.2 病例选择
选择经冠脉造影确诊为冠心病的病例10例(凡是血管狭窄等于或大于50%为阳性病变)。所有研究对象之间没有血缘关系,通过问卷访谈收集研究对象的基本资料、家族史、既往史、吸烟和饮酒史等。并行血常规、血糖、血脂、肝肾功能、心电图等相关检查。剔除TD以及FHD患者、合并周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者、恶性肿瘤、入院前4周内使用降脂等药物者。
1.3 单核细胞的分离及培养
于冠脉造影时无菌采集冠心病患者血液标本10mL,肝素抗凝,于4℃冰箱静置30min。生理盐水1∶1 稀释。用尖头吸管轻轻铺于比重1. 077 淋巴细胞分离液表面,稀释血与淋巴细胞分离液体积比为2∶1,形成清晰界面。离心机离心20 min,离心后单个核细胞悬于分层液面,呈白膜状。用吸管轻轻将单个核细胞吸入另一管内,PBS 清洗2 次(1 500r/ min,5min)。将清洗后的细胞重悬于RPMI1640 培养基。将细胞接种于培养皿中,置于37 ℃、5 %CO2培养箱培养2 h 后,换液,用37℃预热的培养基清洗2 次,将未贴壁细胞洗脱,瑞氏染色鉴定贴壁细胞为单核细胞,占85 %以上。将贴壁细胞用细胞刮片轻轻刮下,重悬于RPMI 1640培养基中,调整细胞浓度为1×106/mL,然后将每mL上述细胞悬液接种于24孔培养板中。加入干预因素后于37℃、5%CO2的培养箱内培养。
1.4 实验分组
按时间分:氟伐他汀(10μmol/L):0h(对照组)、6h、12h、24h组;
按浓度分:氟伐他汀:0(含0.1%DMSO,对照组)、1.0、10、100 μmol/L组。
1.5 逆转录聚合酶链反应
收集各组细胞,按TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。取2μg各组细胞总RNA逆转录合成cDNA,再各取2μL逆转录产物分别进行PCR循环。ABCA1引物序列:上游5-GTA TTT TTG CAA GGC TAC CAG TTA CAT TTGACA A-3;下游5-GAT TGG CTT CAG GAT GTC CAT GTT GGA A-3。PCR扩增产物长度为177 bp。扩增条件:94°C温育5min,94°C变性40s,60°C复性30s,72°C延伸30s共32个循环,末次循环72℃,延伸10 min。反应结束后,取反应产物6μL进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳, Alphalmager 3400 Imaging图象分析系统摄图,并分析各组目的基因及GAPDH基因恢度值,以二者的比值代表各目的基因的表达水平。
1.6 统计学处理
实验所得数据采用(±s)表示,统计分析用SPSS10.0软件,两组间比较采用方差分析及t 检验,P0.05);单核细胞与不同浓度氟伐他汀孵育24h后与空白对照组比较, ABCA1 mRNA表达亦无明显变化(P>0.05)。如图1、图2所示。
3 讨论
单核/巨噬细胞在动脉粥样硬化的形成中起关键作用。循环血单核细胞是动脉粥样硬化斑块部位泡沫巨噬细胞主要来源之一,血液中单核细胞迁入动脉内膜转变为巨噬细胞,单核/巨噬细胞在血管内膜摄取氧化低密度脂蛋白、吞噬过量脂质以及单核/巨噬细胞内脂质转运异常等原因导致胆固醇和脂质在单核/巨噬细胞中大量沉积,形成泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块发生的重要早期事件。
当前,在冠心病的防治中,HDL的作用受到高度重视。HDL对动脉血管壁有直接的保护作用,并参与胆固醇逆转运而降低荷脂巨噬细胞内胆固醇及磷脂,从而稳定动脉粥样斑块,使动脉粥样硬化病变消退。增强胆固醇的逆转运,有利于抗动脉粥样硬化的作用。因此,与HDL代谢相关的基因备受关注。ABCA1基因表达异常能导致细胞内胆固醇沉积,影响HDL的合成与分解,HDL颗粒变小,浓度降低,水平严重缺陷,冠心病的危险性增加[4]。
在动脉粥样硬化血管性疾病的防治方面,他汀类药物降低主要的不良终点事件(如死亡、心肌梗死和中风等)的疗效已超越所有其它的药物,在临床上广泛用于冠心病的防治,具有重要的调脂作用及改善内皮功能、增加纤溶和抗炎症反应等非调脂作用;不仅能通过抑制三羟基三甲基戊二酰辅酶A还原酶阻断羟甲戊酸(MVA)途径以及增加肝脏LDL受体表达而降低血浆LDL-胆固醇的浓度,还能升高HDL。目前对其升高HDL的机理尚未阐明,有报道认为可能是通过降低胆固醇酯转运蛋白的活性,以及促进载脂蛋白A1生成增加所引起。
尽管ABCA1在HDL生成起始步骤中起关键作用,但与Hitoshi A等所做的普伐他汀对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响研究结果一致[5],我们的实验也发现他汀类药物氟伐他汀对冠心病患者单核细胞ABCA1的表达并没有促进作用(P>0.05)。其机理可能为:一方面,他汀类药物抑制HMG-CoA还原酶,使中间产物羟甲戊酸(MVA)及终产物胆固醇的生成减少,而胆固醇及氧化固醇在体内可诱导LXR及ABCA1的表达;另一方面,他汀类药能激活核激素受体PPAR-α及PPAR-γ的表达,二者的激活能诱导LXR的表达,进而促进ABCA1的表达[6]。他汀类药对调节ABCA1基因表达的调控基因具有双重效应,因此,尽管能抑制LXR的表达,但对ABCA1基因的表达并没有表现出明显的抑制作用。这说明他汀类药物升高血浆HDL的机理与ABCA1基因表达没有明显的关系,若与能增强ABCA1基因表达的药物联合用药,将有利于更好地调节脂质代谢。
参考文献:
[1] SACKS FM. The role of high-density lipoprotein(HDL) cholesterol in the prevention and treatment of coronary heart disease: expert group recommendations[J] .AM J cardiol,2002,90(2):139-143.
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[3] ORAM JF. HDL apolipoproteins and ABCA1 partners in the removal of excess cellular cholesterol[J]. Arterrioscler Thromb Vasc Biol, 2003,23(5):720-727.
[4] VAN ECK M, SINGARAJA RR, JAMES ER, et al.Macrophage ATP-Binding Cassette Transporter A1 overexpression inhibits atherosclerotic lesion progression in low-density lipoprotein receptor knockout mice[J]. Arterrioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(4): 929-934.
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[6] MICHAEL MB, CLAIRE LH, CYNTHIA GS, et al. Selective Up-regulation of LXR-regulated Genes ABCA1, ABCG1, and APOE in Macrophages through Increased Endogenous Synthesis of 24(S),25-Epoxycholesterol[J]. Biol Chem, 2007, 282(8): 5207-5216.
(责任编辑:陈涌涛)
Effects of Fluvastatin on the Expression of ABCA1 in Monocytes of
Patients with Coronary Heart Diseasein Vitro
Li Huabo
(Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Hubei institute for nationalities, Enshi 421001,China)
Abstract:AimThe study was designed to examine the effects of fluvastatin onthe expression of ABCA1 mRNA and protein in monocytes of patients with coronary heart disease in vitro. To evaluate the effect of fluvastatin therapy on antiarteriosclerotic.MethodsMonocytes were isolated by density gradient method from blood ofpatients with coronary heart disease, then divided into different group. Different group monocytesincubated with 10.0μmol/L flivastatin for 0h、6h、12h、24h, or incubated with 0、1.0、10、100 μmol/L flivastatin for 24h, respectived. Total RNA of monocytes were abstracted by TRIzol reagent. The levels of ABCA1 mRNAwere measured by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). ResultsRT-PCR demonstrated that fluvastatin couldnt increase the expression of ABCA1 mRNA in monocytes at different concentrations and times. (compared with control group:P>0.05). Conclusions Fluvastatin couldnt increase ABCA1 mRNA and protein expression in monocytes.
Key words:Monocytes;Fluvastatin;ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1);Atherosclerosis
