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【摘要】 目的 直接从临床上获得的人关节软骨细胞,骨关节炎软骨细胞在体外研究中,对临床上防治OA有直接指导作用。方法 细胞凋亡和骨关节炎的发生发展密切,通过形态学及细胞生化学的方法;维持各层软骨细胞活性和平衡是关节软骨维持正常功能重要条件。中药的作用机理可以改善软骨细胞功能、促进软骨的修复。结果 软骨细胞凋亡过盛可能是软骨退变发展成膝关节骨性关节炎的重要原因之一。结论 软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,软骨细胞在软骨形成、代谢节修复中起着重要的作用。随着细胞分子生物学的发展,国内外许多学者研究发现软骨细胞凋亡在OA的发生发展中起到关键作用。
【关键词】骨关节炎;细胞凋亡;软骨细胞;细胞代谢
骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是一种以关节软骨退行性变和关节周围骨质增生为病理性特征的慢性进行性骨关节病。随着人口的老龄化,骨性关节炎已成为及常见的疾病。多年的研究提示,在诸多因素影响下,关节软骨细胞外成分的合成减少与降解增加,是造成骨性关节炎软骨变形的重要因素之一。
OA是由于机械性和生物性因素相互作用,使关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨合成与分解的正常进程失去平衡的结果。成人正常关节软骨中,软骨细胞占整个软骨体积的2%以下,其余为大量的细胞外基质,主要由胶原(大部分为II型,其他型胶原较少)和蛋白聚糖组成,蛋白聚糖主要以软骨聚集蛋白聚糖的形式存在。正常情况下,软骨基质的分解与软骨细胞合成基质的速率保持平衡,是软骨的形态和功能得以维持。由于机械性磨损或理化因素致使软骨破坏或降解加快,或者因软骨细胞合成基质收到抑制或其他因素的影响,使软骨修复能力下降后,最终可导致骨关节炎形成。
目前针对骨关节炎的体外研究,主要集中在兔关节软骨细胞的培养及诱导成模,动物的软骨细胞往往增生活跃,并且由于种属间差异,只能从一定程度上说明研究的意义。而直接从临床上获得的人关节软骨细胞,尤其是骨关节炎软骨细胞在体外研究中更能说明问题,因为它更符合实际生理状态,研究结果更可信,对临床上防治OA有直接指导作用。
1 骨性关节炎(OA)的发病机理研究探讨
在OA的病理过程中,关节软骨细胞及滑膜细胞分泌过量的基质金属蛋白酶,打破了MMP-TIMP(组织金属蛋白酶抑制剂)的平衡,造成对关节软骨ECM的国度降解,是软骨逐渐出现腐烂、溃疡、缺失等一系列退行性变的重要原因。MMPs可降解软骨关节ECM中的II型胶原、弹力纤维和蛋白多糖等。前者使软骨的拱形纤维结构破坏而受损,蛋白多糖的降解测试软骨失去弹性,其包绕胶原纤维的分子筛滤过作用下降从而导致关节软骨更易受到降解酶的作用而破坏。
机制金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一组锌依赖性的蛋白水解酶,能够特异性的降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、蛋白质的组成部分和裂解信号蛋白质。主要参与细胞外基质代谢,与正常组织塑性和病理状态下细胞外基质退变有关。MMPs以无活性酶原形式出胞,在各种炎症介质调控下被激活,导致细胞外基质的降解,同时它们能被特定的蛋白抑制物(如TIMP)所抑制。
MMPs在骨关节炎关节软骨的退变中起着重要的作用。酶和酶抑制物水平失调是OA的可能致病机制,在OA中的软骨关节内存在MMPs及其抑制物之间的不平衡,关节软骨的破坏程度与软骨降解酶的含量呈正相关。根据作用底物,MMPs可分为胶原酶、明胶酶和间充质溶解酶等,而在OA病理生理中,研究较多的是MMP-1(胶原酶-1)和MMP-13(胶原酶13)。它们对细胞外基质尤其是II型胶原酶有很强的降解能力,是目前在软骨破坏中研究较多的胶原酶指标。OA时它们可由软骨细胞或滑膜细胞生成,研究表明,在OA关节液以及病变部位软骨中,MMPs的活性增高,而且继发于软骨破坏后。
白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)与肿瘤坏死因子(TNF-α)是参与OA发病进程中的重要递质,是炎症发病反应的重要调节剂,是调节炎症的始动因素[1]。白介素1(interleukin-1,IL-1)。近年来,人们逐渐认识到白介素1特别是IL1-β在骨关节炎的发病中起着重要的作用,并认为IL-1β水平的不断升高是骨关节炎软骨进行性退行性变的重要原因之一。
有人应用特定的基因转染载体将IL-1受体拮抗蛋白基因转移到存在病变的关节软骨或滑膜组织中,使该基因在关节内大量表达,从而阻断病理状态下所产生IL-1的破坏作用,达到预防、治疗和长期维持骨关节炎缓解状态的目的。Ghivizzani等将IL-1β基因转到兔滑膜组织中,结果诱导出了典型的关节炎改变。IL-1对OA发生的影响是多方面的。白介素-6(interleukin-6,IL-6)是具有多种生物学活性的细胞因子,包括激活B细胞和T细胞,以及产生急性期蛋白[2]。正常及OA软骨中分离的关节软骨细胞都能自发分泌IL-6,而正常人滑膜免疫组化检测不出IL-6的存在,OA滑膜内壁细胞则可以免疫组化显示。
IL-1β是体内广泛存在的与炎性有关的因子,体外培养的正常软骨细胞和滑膜组织细胞都能够产生微量的IL-1β。据报道,IL-1β能明显影响关节软骨细胞合成基质,从而在OA发病过程中扮演重要角色。IL-1β对关节软骨降解作用的主要降解作用的主要机制可能在于促进软骨中MMPs合成和分泌,抑制基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)合成,而前者对基质有较强的溶解作用。由此,IL-1β被用于诱导OA模型产生,而IL-1受体阻滞剂(IL-1Ra)也可用于OA模型治疗,并取得初步效果。
肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。肿瘤坏死因子-α以旁分泌的方式作用于Th细胞,加强其IL-2分泌,提高IL-2受体的表达水平、促进T细胞的活化和扩增。在OA动物模型中,OA关节软骨免疫组化染色其基质及细胞中TNF-α及受体均呈阳性反应,且强度、范围与OA严重程度相平行。
细胞凋亡和骨关节炎的发生发展较为密切,Hashimoto等研究发现正常关节软骨可出现细胞凋亡,但检出率低,主要位于表层,OA患者出表层的数量增加外,中增均有凋亡细胞存在。Blanco等认为关节软骨降解最终完全丧失是骨关节炎的主要病理特征,通过形态学及细胞生化学的方法发现在骨关节炎患者的关节软骨内有凋亡细胞的存在。细胞外基质(extra cellular matrix,ECM)各成分平衡是维持各层软骨细胞活性的重要条件,细胞凋亡与基质崩解密切相关。
切片显示,OA患者关节软骨富含凋亡细胞的区域伴有大量蛋白多糖降解,表层移行软骨细胞凋亡最多,且基质降解最严重。Heraud等观察人的正常和OA股骨头关节软骨发现,OA软骨细胞中有18%～21%软骨细胞表现出调往特征,而正常关节软骨只有2%～5%凋亡细胞.Cao等发现蛋白多糖聚合物的降解产物之一G1结构域由于与透明质酸的结合不易进入循环系统,易在滑液中及软骨中积累,通过降低细胞间粘附诱导软骨细胞凋亡,滑膜是关节滑动结构中的重要组成部分,其中有大量的血液供应和丰富的神经支配,滑膜的分泌吸收和营养代谢是关节软骨维持正常功能的前提。
细胞凋亡是受基因调控的一种细胞主动死亡过程,参与机体许多生理和病理过程,软骨细胞的异常凋亡对骨关节炎的发生于发展起至关重要的作用。近年来的研究证明,软骨细胞调节细胞凋亡有两条通路:NO诱导途径和Fas介导途径。Fas又称APO-1或CD95,Fas/CD95介导的凋亡通常包括其死亡区与连接程序分子FADD(Fas-associated protein with death domain)相连结,以及FLICE(CD95L白细胞介素-1β转换酶)的募集,继而发动ICE的其他家庭成员蛋白水解酶的激活,如caspase-8和caspase-3,产生caspase家族级联反应,最终导致凋亡发生。已有研究证实,能导致细胞氧化损伤的因素均能引起细胞凋亡,过氧化氢可以引起剂量依赖性细胞死亡,但浓度低于100μmol/L的过氧化氢主要导致细胞凋亡,浓度超过100 μmol/L则细胞坏死开始占优势。
OA发病机制中除了酶以及抑制物的代谢失衡外,软骨细胞的凋亡以及自由基也起了重要作用。细胞凋亡(apoptosis)是一种基因控制并依赖ATP功能的细胞自主性死亡方式。随着细胞分子生物学的发展,国内外许多学者研究发现软骨细胞凋亡在OA的发生发展中起到关键作用。
2 骨关节炎中软骨细胞的研究发现
软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,软骨细胞在软骨形成、代谢节修复中起着重要的作用。关节软骨细胞增殖和凋亡正常情况下处于动态平衡状态,使关节软骨在总体上保障其细胞数量及形态和功能的稳定。软骨细胞凋亡过盛可能是软骨退变发展成膝关节骨性关节炎的重要原因之一。
刚分离下来的原代软骨细胞呈大小均一的遮光性较强的球形。正常原代软骨细胞48 h后完全贴壁,细胞大部分呈圆形、椭圆形或短梭型外观,部分区域软骨细胞呈集落生长,约7 d后长满瓶壁,密疏不一,有的区域还可见大量基质包绕的结节样细胞群落;传代后一般24 h即可完全贴壁,第二代软骨细胞3 d左右即可长满,细胞仍以椭圆形多见,但随着传代次数的增加,细胞中梭型细胞逐渐增多,分泌和增殖能力下降,传代周期延长。而骨关节炎组原代细胞贴壁普遍较晚,细胞形态多不规则,约9 d后才能长满瓶壁,多为单层生长,集落样生长和结节样细胞群落少见;传代后贴壁也较晚,第二代软骨细胞需4 d左右长满瓶壁,细胞中梭型细胞增多明显,有时可见浮起的死亡细胞,分泌和增值能力下降。
目前原代软骨细胞酶消化分离的方法很多,常用的有Green法和Klagsbrun法等。体外培养观察表明原代正常软骨细胞具有良好的附壁生长和增殖活性,细胞外基质富含II型胶原和蛋白多糖聚集体,直至传到第4代仍具有较好的软骨细胞生物学特性。相比较而言,骨关节炎软骨细胞的贴壁和增殖较慢,II型胶原和蛋白多糖的含量也较少,传到第4代软骨细胞生物学特性基本消失。同时,细胞凋亡明显增多,对相同浓度IL-1β的诱导反应更加显著。而IL-1β能促进基质金属蛋白酶(MMPs)生成同时降低基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)的合成,还能够刺激中性蛋白酶和前列腺素E2(PGE2)的产生,加重关节的炎性反应,在软骨细胞的降解、退变过程中起到最重要的作用[3]。
OA中NO主要来源于软骨细胞,通过iNOS催化生成。研究表明,正常软骨细胞不表达iNOS,在OA中,软骨细胞则表达iNOS,并产生NO参与OA的病变过程。实验表明,IL-1β能通过NO介导,抑制软骨细胞蛋白多糖和胶原的合成,诱导基质金属蛋白酶的形成于释放,导致基质降解,还可抑制软骨细胞的增值;同时也参与了软骨细胞的凋亡过程。元建洪等研究了IL-1β对人软骨细胞MMP-13的影响,报道它们存在剂量依赖关系,但未对MMP-1进行研究。
Ieda等应用人软骨肉瘤细胞进行实验,发现IL-1β可以通过p38途径影响MMP-1/-13的变化,但并未对两者的不同进行研究[4]。Fas途径。Fas及FasL在细胞表面的表达手细胞密度的影响,低密度区细胞(细胞处于未融合状态)Fas及FasL的表达,要高于高密度去细胞(细胞处于融合状态),但后者被主动性抗体诱导儿凋亡的软骨细胞数目却是前者的15倍,提示在低密度培养时,保护性的抗凋亡机制被激活,使得软骨细胞对Fas途径介导的凋亡敏感性下降。
3 药物对骨性关节炎的治疗进展
中药的作用机理引起膝OA军事从软股退化开始,继而发生其骨质和滑膜的改变。随着现代医学的发展,对其病机和中药的作用机制的研究也取得了进展。中医认为本病主要为筋骨失养,是肝肾虚弱所致。这与血瘀气滞病较为相似,因而中药医补肾壮骨和养血柔肝类为主。现代药理研究补益肝肾可改善微循环、防止自由基过量产生、调节内分泌状态、增强免疫功能,使软骨蜕变等表现得到改善和修复,从而达到防治和改善病情的目的。同时配以活血通络、温经止痛之品。它们在改善软骨细胞功能、促进软骨修复、抑制滑膜炎性改变、延缓软骨退变等方面也能起积极作用[5]。
丹参主要成分丹参酮I、II、IIA,主要功效为活血化瘀畅行血脉、通利关节、行血分、苦降开泄以散瘀等。研究发现马钱子及其主要单体成分马钱子碱等对软骨细胞凋亡及合成代谢有较大影响。其对兔膝OA有一定保护作用,对正常软骨细胞有促进增值而无诱导凋亡作用。马钱子及其主要单体马钱子碱在一定剂量时对不同途径下诱导的软骨细胞凋亡有抑制作用,并在抑制软骨细胞凋亡的同时对软骨细胞合成代谢功能有一定的改善作用。
牛维等采用软骨细胞培养技术观察补肾活血方对软骨细胞的增值和细胞总蛋白合成的影响,从细胞分子水平研究该方防治膝OA的作用机制。研究表明该方含药血清可促进软骨细胞的代谢与软骨细胞的增值以及软骨细胞蛋白质的合成。邵敏采用兔软骨细胞培养技术观察补肾活血方对SOD及一氧化氮合酶(NOS)的影响,从细胞分子水平研究该方防治软骨蜕变的作用机制。结果表明该方对软骨细胞的保护作用是可提高SOD活性,阻止自由基的生成,抑制NOS的活性,减少NO的生成,从而阻止NO、自由基对软骨细胞结构的损伤和破坏。刘坤等认为不同中药对软骨细胞银子的表达呈现出不同的效应,益肾方和柔肝方能降解血清中透明质酸的水平提高膝关节透明质酸的水平,对延缓软骨退变有重要意义。
殷惠芬等按照Hulth法建立兔膝OA模型,Feulgen染色测定图软骨细胞核DNA含量的图像分析表明,中药复方(独活、威灵仙、萆�、鸡血藤、桑寄生、川牛膝)可明显减少兔软骨细胞核内异染色质的数量;末端原位标记法(TUNEL法)观察软骨细胞凋亡情况、琼脂糖凝胶电泳观测软骨细胞DNA特征性梯形带,结果显示该中药复方能减轻内源性DNA氧化性损伤,减少DNA键断裂及分子片段数量,减少兔软骨细胞凋亡数目。
抑制炎性细胞因子和NO含量;采用石膏管形固定致兔膝OA模型造模方法,测定关节液中IL-1β、TNF-α的含量,结果表明古方�莶丸能降低实验动物关节液中IL-1β、TNF-α的含量,具有一定的抗炎作用;光镜和电镜下观察表明�莶丸可改善关节固定造成的膝关节面软骨的退行性改变,对处于病变条件下的软骨具有保护作用,对已造成退行性改变的关节软骨有减轻和改善其病变程度的作用。安莉萍采用兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶方法建立兔膝OA模型,放射免疫分析法(RIA)检测血清及关节腔液IL-1β、TNF-α含量,以亚硝酸盐还原酶法测定血清及关节腔液中炎性细胞因子和NO的产生,起到减轻膝关节OA兔软骨损伤的作用。
镇痛剂对轻、中度关节炎有效,对乙酰氨基酚是这一类药物的代表药物,是治疗骨关节炎的传统制剂[6]。轻度或中度患者应用对乙酰氨基酚可以取得与应用非甾体抗炎药一样的效果。非甾体抗炎药(NSAIDs)对于退行性骨关节病的疼痛和僵硬是一种常规用药,选择性COX-2抑制剂塞来昔布和罗非昔布既能消炎镇痛,又极少出现NSAIDs并发的严重胃肠道反应。透明质酸钠是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成,该双糖单位以糖苷键相结合,并重复连接成链状聚合物。透明质酸钠关节腔内注射治疗骨关节炎与NSAIDs口服疗效相当,起效不如糖皮质激素快,但是维持时间比较长。
4 实验性对骨性关节炎(OA)临床研究
4.1 对实验性OA血液循环障碍的影响 袁忠治选取兔一侧膝关节切断其前交叉韧带,另一侧膝关节作假手术建立兔膝OA模型,观察膝关节大体形态学、测量股骨内髁软骨厚度和面积、测量股骨内髁关节滑膜细胞层厚度,实验表明补肾活血中药(当归、鸡血藤、熟地黄、川芎、丹参、牛膝、红花、益母草、骨碎补、泽兰、丹皮、淫羊藿、车前子)可明显减轻实验性OA关节软骨的缺损。明显增加。
陈述祥采用兔左膝伸直位管型石膏固定8周的方法建立OA动物模型,进行血液流变学检测和滑膜、软骨标本的组织学观察。结果中药复方骨痹灵口服液(鸡血藤、黄芪、骨碎补、肉苁蓉、防风、鹿角胶、怀牛膝、当归、白芍)能够有效改善家兔膝OA模型血液粘滞度,并促进软骨细胞增生、减轻滑膜组织炎症,从而达到治疗OA的目的,其效果优于芬必得胶囊。
高铁祥通过手术结扎右侧股静脉的方法复制右膝关节炎模型,观察中药复方胶囊(熟地、山药、枣皮、泽泻、枸杞等)等的治疗作用。结果中药复方胶囊组的股内压明显降低,心脏全血黏度、血浆黏度显著降低,心脏血中NO浓度显著降低。实验表明,中药复方胶囊对实验性OA有抑制作用。杨荣全研究骨脉康胶囊的药理作用,结果骨脉康胶囊能显著减少小鼠皮下血肿模型的血斑面积并显著缩短血斑消失时间,说明它对小鼠皮下血斑吸收有显著的促进作用;在整体动物实验中,说明它对小鼠皮下血斑吸收有显著的促进作用;在整体动物实验中,骨脉康胶囊低、中、高剂量组均有显著的抗血小板聚集功能。上述作用为骨脉康胶囊活血、化瘀、通络作用提供了药理学依据。
4.2 对实验性OA关节积液及生理生化指标的影响 陈卓夫按照Hulth方法建立兔膝OA模型,参照Gotdbrg VM法对膝关节活动进行临床评分,同时进行关节液量的测定、软骨羟脯氨酸及水量的测定、血清碱性磷酸酶与酸性磷酸酶含量的测定。结果中药化痰软坚片(白芥子、天竺黄、乳香、没药、当归、地龙、鹿衔草、鹿角霜、骨碎补、枸杞、黄芪)能够改善OA模型家兔关节炎的临床症状;化痰软坚片中、高剂量组家兔的关节腔内液、关节软骨中羟脯酸及水分含量、血清碱性及酸性磷酸酶均有显著或非显著性改变,低剂量组也有好的趋势,表明化痰软坚片能改善OA模型家兔关节炎症的各种生理生化指标。
4.3 骨性关节炎(OA)临床研究 骨性关节软骨中虽然软骨细胞只占很少的一部分,但发现它的生存或死亡在OA关节软骨中起重要作用。退化的软骨细胞随OA的严重程度增加而增加。在本研究中显示,OA的关节软骨光镜下软骨细胞数减少,排列紊乱并有成簇现象,细胞核固缩,呈浓密深染状态。软骨细胞在机械、炎症、生化或免疫等损伤条件下发生凋亡、坏死、增殖等反应,亦可通过调控合成基因及分解基因的表达,使合成减少或基质降解。炎症介质与软骨细胞、滑膜细胞的凋亡、坏死之间形成恶性循环,而机械作用是一种起始因素,它们相互渗透,互为因果。
骨和软骨组织、关节软骨中含有多种细胞因子及其受体,可通过自分泌或旁分泌的方式对骨和软骨的形成和修复起局部调节作用,维持关节软骨的正常形态和功能。其活性发生改变,则将导致关节软骨基质成分丢失和进行性破坏。在骨的微环境中,有许多生长因子参与调控成骨细胞的代谢。其中IGFs具有重要调节作用。其中IGF-II在骨中含量丰富,与骨代谢密切相关。作为一种自分泌调节因子,IGF-II能有效的促进骨细胞的有丝分裂和成骨细胞的功能分化增强碱性磷酸酶的活性和钙盐沉着,对骨骼体积增大及长度延长均有着重要的作用。
骨性关节炎的发病机制现在还没有完全明确,而骨性关节炎的治疗也是一个棘手问题[7],一般用药对骨性增生改变的疗效并不明显,而关节置换存在着费用大、风险性高、假体容易出现问题等,目前在骨关节炎的基因治疗方面,国际上还处于动物实验阶段,但是软骨细胞凋亡在OA软骨退变发生发展中的如何作用,以及细胞凋亡与药物治疗OA疗效之间的关系如何,是一个值得研究的崭新课题,将来通过对软骨细胞凋亡调控机制的认识,进一步研究中药特别是补肾中药对软骨细胞代谢的影响,将最终为OA防止开辟一条新的途径。
参 考 文 献
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