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【摘要】 目的 建立颈痛胶囊的质量标准。方法 采用薄层色谱法对处方中延胡索、川芎、白芍、葛根进行定性鉴别;用高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1含量。结果 薄层色谱法专属性强;人参皂苷Rg1平均回收率为96.08%,RSD为0.92%。结论 高效液相色谱法简便、准确,重复性好,可作为颈痛胶囊的质量控制标准。
【关键词】 颈痛胶囊;薄层色谱;高效液相;质量标准
Study on quality standard of Jingtong Capsules
SUN Xiang-min.
Central Hospital of Qilu Petrchemical Hospital Group,Zibo255400,China
【Abstract】 Objective To establish the quality standard of Jintong capsules.Methods Thin-layer chromatography was employed to identify Rhizoma Corydalis,Rhizoma Ligustici Chuanxiong, White Peony Root and Radix pueraiae.The content of Ginsenoside Rg1determined by High Pressure Liquid Chromatography.Results The study on the quality control showed that the characteristic of identification by TLC was distinct and highly specific.The average recovery of Ginsenoside Rg1was 96.07% with RSD at 0.33%.Conclusion The method is easy,accurate and reproducible.It can be used effectively for the quality control of this preparation.
【Key words】 Jintong capsules;Thin-layer Chromatography;High Pressure Liquid Chromatography; Quality Standard
作者单位:255400齐鲁石化医院集团中心医院
颈痛胶囊由三七、川芎、延胡索、白芍、威灵仙、葛根、羌活七味药组成,具活血化瘀、行气止痛作用。用于神经根型颈椎病属血瘀气滞、脉络闭阻证。症状:颈、肩或上肢疼痛,发僵或窜麻、窜痛等。为了有效地控制本品质量,对延胡索、川芎、白芍、葛根进行了薄层鉴别,采用高效液相色谱法对三七中人参皂苷Rg1进行含量测定,结果满意。
1 材料
1.1 仪器 AE135型电子分析天平(瑞士METTLER),SSI型高效液相色谱仪,Lab Alliance泵(天津市兰博实验仪器设备有限公司),C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱 (大连依利特科学仪器有限公司),硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂)。
1.2 试剂 人参皂苷Rg1对照品(供含量测定用,中国药品生物制品检定所,批号:10703-200810);延胡索对照药材、延胡索乙素对照品、川芎对照药材、芍药苷对照品、葛根素对照品(中国药品生物制品检定所);颈痛胶囊(自制);阴性对照品(自制);乙腈为色谱纯;水为纯化水;其余所用试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 定性分析
2.1.1 延胡索TLC鉴别 取本品内容物4 g,加乙醇50 ml,加热回流1 h,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加水10 ml使溶解,加浓氨试液调至碱性,用乙醚提取2次,20 ml/次,合并乙醚液,挥干,残渣加无水乙醇1 ml使溶解,作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1 g,同法制成对照药材溶液;再取延胡索乙素对照品,加无水乙醇制成1 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验,吸取上述三种溶液各5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正已烷-氯仿-甲醇(7.5�∶�4�∶�0.4)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中,在与对照药材和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。见图1。
2.1.2 川芎TLC鉴别 取本品内容物4 g,加乙醇20 ml,加热回流1 h,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加无水乙醇2 ml使溶解,作为供试品溶液。另取川芎对照药材1 g,加乙醚10 ml,超声处理10 min,滤过,取滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法(录VI B)试验,吸取上述两种溶液各5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以正已烷-醋酸乙酯(9�∶�1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。见图2。
图1 延胡索TLC色谱图
1.阴性对照 2.延胡索乙素对照品 3.延胡索对照药材 4~6.样品
图2 川芎TLC色谱图
1.阴性对照 2. 川芎对照药材 3～5. 样品
2.1.3 白芍TLC鉴别 取2.1.2项下供试品溶液作为供试品溶液。另取芍药苷对照品,加无水乙醇制成2 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验,吸取上述两种溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(40�∶�5:�∶�0�∶�0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。见图3。
图3 白芍TLC色谱图
1.阴性对照 2. 芍药苷对照品 3～5. 样品
图4 葛根TLC色谱图
1.阴性对照 2. 葛根素对照品 3～5. 样品
2.1.4 葛根TLC鉴别 取2.1.2项下供试品溶液作为供试品溶液。另取葛根素对照品,加无水乙醇制成1 mg/ml的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)试验,吸取上述两种溶液各5 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以氯仿-甲醇-水(7�∶�2.5�∶�0.2)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。见图4。
2.2 定量分析
2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.05%磷酸溶液(20�∶�80)为流动相;检测波长为203nm;柱温40℃;流速1.5 ml/min。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于2500。
2.2.2 溶液的配制 对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1适量,加乙腈-水(2:8)溶液制成每1 ml含人参皂苷Rg10.5 mg的溶液,即得;供试品溶液的制备取本品内容物约0.8 g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚100 ml,加热回流3 h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,连同滤纸筒移入锥形瓶中,精密加入水饱和的正丁醇溶液50 ml,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,滤过,精密量取续滤液25 ml,水浴蒸干,残渣加乙腈-水(2�∶�8)溶液溶解,并定容至5 ml,滤过,取续滤液即得;阴性对照溶液的制备按处方比例制备不含三七的阴性对照品,按供试品溶液制备方法制备。以上3种溶液按上述色谱条件进样,测定。结果阴性对照在人参皂苷Rg1峰相应的保留时间处无干扰。
2.2.3 线性关系考察 精密称取人参皂苷Rg1对照品20 mg(20.14 ml),置10 ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,再分别精密移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ml各置5 ml量瓶中,以流动相稀释至刻度,作为对照品溶液,分别进样20ul,测定峰面积,记录色谱图,以峰面积为纵坐标,进样量为横坐标, 得回归方程为:Y=2194415.1,x=21894.8,r=0.9995,表明人参皂苷Rg1在4.028～20.14 μg之间呈良好的线性关系。
2.2.4 精密度试验 精密吸取浓度为0.481 mg/ml对照品溶液,在相同的色谱条件下,重复进样6次,按上述色谱条件测定,人参皂苷Rg1峰面积的RSD为0.64%。
图5 人参皂苷Rg1对照品HPLC色谱图
图6 颈痛胶囊样品HPLC色谱图
图7 阴性样品HPLC色谱图
2.2.5 重现性试验 精密称取同一批样品6份,按供试品溶液制备方法制备,在相同色谱条件下进样,考察方法的重现性,RSD为1.02%。
2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液,分别在制备后0、1、2、3、4、6 h,按上述色谱条件,测定其含量, RSD为1.25%。结果表明,供试品溶液在6 h内稳定,测定结果无显著变化。
2.2.7 回收率试验 取已知含量的颈痛胶囊样品0.4 g,加入人参皂苷Rg1对照品约3.4 mg。按供试品溶液制备项下方法处理,测定。
表1
人参皂苷Rg1加样回收率测定结果(n=6)
样重编号人参皂苷(g)加入人参皂Rg1(mg)测得量苷Rg1(mg)回收率(mg)平均回收率(%)RSD(%)(%)
10.41563.523.426.85 97.37
20.41103.48 3.35 6.68 95.52
30.39583.353.386.5995.8696.08 0.92
40.39943.383.506.7696.57
50.39533.343.486.6494.83
60.37923.213.566.6496.35
2.2.8 样品测定 取本品内容物约0.8 g,精密称定,置索氏提取器中,加乙醚100 ml,加热回流3 h,弃去乙醚液,药渣挥去乙醚,连同滤纸筒移入锥形瓶中,精密加入水饱和的正丁醇溶液50 ml,密塞,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,滤过,精密量取续滤液25 ml,水浴蒸干,残渣加乙腈-水(2�∶�8)溶液溶解,并定容至5 ml,滤过,取20 μl进样,测定。
表2
人参皂苷Rg1含量测定结果(n=3)
批号含量(mg/粒) 平均含量(mg/粒)
0808094.274.324.30
0808094.354.31 4.33
080810 4.224.30 4.26
3 讨论
3.1 本品薄层色谱鉴别做了阴性对照试验,结果表明薄层斑点不受样品中其他各药的干扰,专属性强,简单易行,可作为本品定性检测的指标。
3.2 原制剂颈痛颗粒[1]标准采用薄层扫描法测定三七中人参皂苷Rg1的含量,实际工作中发现该方法受环境影响较大,实验误差大,且操作繁琐。现参照中国药典2005年版一部[2]人参项下的含量测定方法,改为高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1的含量,方法简单、准确性高。
3.3 含量测定中选择色谱条件时,曾对流动相包括溶剂系统的组成和比例进行了探索,根据参考文献对多种溶剂系统进行了选择:①甲醇-水(25∶75);②甲醇-8%醋酸溶液(30∶70);③乙腈-水(20∶80);④乙腈-水-冰醋酸(20∶80∶1)。根据分离情况,最后选择乙腈-水(20∶80)为流动相,流速1.5 ml/min。
3.4 作者曾对样品提取方法进行了考察,分别采用乙醚和氯仿进行了脱酯试验,结果氯仿脱脂,干扰成分较多,分离效果不如乙醚脱脂效果好,故选择乙醚作为脱脂溶剂。样品经脱酯后分别采用水饱和的正丁醇溶液、甲醇溶液回流和超声2种提取方法,经测定,超声和回流含量相近,故采用本文中的提取方法。通过测定本品中人参皂苷Rg1的含量,3批产品含量稳定,平均每粒胶囊含人参皂苷Rg14.30 mg,人参皂苷Rg1的含量>3.8 mg。
参 考 文 献
[1] 中华人民共和国药典. 化学工业出版社,2005,10.
[2] 国家药典委员会. 国家药品标准,2004,43:13-14.
