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【摘要】 目的 探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)与Clusterin的表达及其与血管瘤消退的关系。方法 采用免疫组化SP法检测Caspase-3与Clusterin在34例血管瘤和6例正常皮肤组织中的表达。结果 Caspase-3与Clusterin在34例血管瘤组织中阳性表达率，增生期分别为31．3%、81．3%，消退期分别为72．2%、38．9%,而在正常皮肤均不表达，其中，Caspase-3在增生期中的表达低于消退期，差异有统计有统计学意义(P[1]。血管瘤好发于头面部，多见于婴幼儿及儿童，其自发消退机理一直不太清楚。目前认为血管瘤的发生发展和自行消退与细胞凋亡有联系[2]。本研究采用免疫组织化学SP法检测34例血管瘤组织和6例正常皮肤组织的血管内皮细胞中凋亡相关因子Caspase-3与Clusterin的表达，探讨其表达与血管瘤的发病机制，以及与内皮细胞凋亡的关系，为全面阐明血管瘤的发病机制提供实验资料。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 标本来源 标本均选自广东医学院附属医院整形外科2003~2005年术前未经任何治疗，仅行手术切除且完整临床和病理资料的血管瘤患者34例，男14例，女20例，年龄3个月~20岁。病程15 d~20年。
1．1．2 标本分组 全部收集标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色后，经我院两名副教授以上职称的病理医师诊断确认，并按Mulliken分类标准进行分组:其中增生期16例、消退期18例。另取同期含有血管组织的6例正常皮肤标本作对照，标本均取自行植皮手术的患儿。
1．1．3 主要试剂 鼠抗人caspase-3单克隆抗体、鼠抗人clusterin单克隆抗体(均购自武汉博士德公司)，还有免疫组化超敏S-P试剂盒(由福州迈新生物制品公司提供)。
1．1．4 主要仪器 ZBY149-83型电热恒温鼓风干燥箱；S-648型电热恒温水浴箱；Canon-600照相机；普通家用高压锅和普通冰箱。
1．2 实验方法
1．2．1 常规染色 取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色和封固。
1．2．2 免疫组化S-P法检测Caspase-3与clusterin的表达 根据试剂盒提供的说明书操作，主要步骤:①组织切片4 μm，常规脱蜡、水化；②柠檬酸缓冲液(pH=6．0)高压法修复抗原；③3%过氧化氢，37℃孵化10 min以封闭组织生物酶，PBS冲洗5 min×3次；④正常山羊血清37℃孵化10 min以减少非特异性反应；⑤一抗(Caspase-3与clusterin)，每张切片加50 μl，4℃孵育过夜，PBS冲洗5 min×3次；⑥适量第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，密闭，37℃孵化10 min，PBS冲洗5 min×3次；⑦每张切片加100 μl新鲜配制的DAB溶液(蒸馏水∶DAB∶Buffer∶%H2O2为20∶1∶1∶1)37℃染色时间约为5 min，自来水冲洗，终止反应；⑧苏木素复染(5 min)，中性树胶封固。
另以不同时期血管瘤组织切片，以PBS代替一抗，染色方法同上，作空白对照。取正常皮肤组织切片3张，用caspase-3、clusterin一抗进行染色，方法同上，作为正常对照。
1．2．3 结果判断
每批免疫组化均设有已知阳性和用PBS代替一抗的空白对照，以及用正常皮肤的正常对照。以内皮细胞胞核和(或)胞浆呈棕黄色为阳性细胞。参照卢晓哗等[3]方法，每间隔一个高倍视野选取一个视野进行观察，每张切片至少观察5个高倍视野，并根据1996年《全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会》标准，阳性细胞数75%为强阳性(+++)。
1．2．4 统计学处理
所有数据采用SPSS11．0软件进行四格表的Fisher确切概率法与Spearman相关分析法检验统计分析。检验水准a=0．05。
2 结果
2．1 HE染色组织学光学纤维镜观察
2．1．1 根据Mulliken分类法，结合组织学观察34例手术切除的血管瘤标本，有16例是增生期，18例为消退期。
2．1．2 组织结构
增生期血管瘤:血管瘤内可见肥大、功能活跃的内皮细胞增生；基底膜增厚，呈多层，形成含有毛细血管大小的管腔或无管腔的肿块；肥大细胞的数量大约是正常组织的30~40倍。消退期血管瘤:血管瘤内细胞成分较少，变得扁平；血管腔更加明显，薄壁，形成叶状结构；血管周、叶间和叶内纤维脂肪组织沉积。
2．2 免疫组化结果
2．2．1 Caspase-3与Clusterin在血管瘤不同时期与正常皮肤中的表达
Caspase-3阳性表达呈棕黄色，在血管瘤组织中定位于内皮细胞的胞核和(或)胞浆；正常皮肤的血管内皮组织中Caspase-3无表达。Caspase-3在血管瘤组织中表达高于正常皮肤组织(P[4]通过检测DNA裂解的方法(TUNEL法)直接发现血管瘤消退期的凋亡较增殖期增加了5倍。Yuan等[5]亦指出，在血管瘤的自然消退中，凋亡是一个重要的促进因素。然而Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶[6]，在大多数情况下细胞凋亡通过Caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)介导的信号途径完成，中心环节是效应分子Caspase-3的激活。这一途径受多种调控因子控制，包括激活因子与抑制因子[7]。Yang 等[8]研究表明，在血管瘤增生期向消退期转变的过程中，Caspase-3诱导其血管内皮细胞凋亡起了重要的促进作用。Clusterin是一种新近被发现的凋亡抑制因子，在许多肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。Zhang等[9]通过体外细胞培养发现，Clusterin通过阻碍Bax的寡聚化从而抑制Caspase介导的细胞凋亡。
陈刚和唐伟[10]认为，Clusterin可能通过抑制细胞凋亡在前列腺癌的发生发展中发挥重要的作用；罗俊航等[11]实验也显示，在膀胱癌中，Clusterin蛋白的表达与肿瘤的预后显著性相关(1og-rank=5．88，P=0．015)。
本研究结果发现，在血管瘤内皮细胞中，Caspase-3在增生期表达低于消退期(P
