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【摘要】 目的 通过研究不同CT值的脊柱结核病灶骨中骨保护蛋白(OPG)和骨保护蛋白配体(OPGL)的表达情况以及与平均CT值的关系，揭示OPG和OPGL参与脊柱结核的病理过程，从分子水平深化对脊柱结核病灶骨硬化发生机制的认识。方法 用PV-6000二步法免疫组化检测技术测定OPG和OPGL的平均光密度及阳性面积比，并将其比值与平均CT值进行相关分析。结果 OPG和OPGL表达强度的比值与平均CT值呈正相关。结论 OPG和OPGL表达的动态不平衡导致了脊柱结核病灶周围硬化骨的产生。�
【关键词】
脊柱结核；OPG；OPGL；免疫组化；CT
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The expression of OPG and OPGL in the focus of different CT value of spinal tuberculosis
HE Yu-ze, WANG Zi-li， MA Teng. Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou221002, China
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【Abstract】 Objective
To explain the role of OPG and OPGL in the pathological process of spinal tuberculosis through studying the expression of OPG and OPGL in section of different CT value of spinal tubercular infectious focus. To analyze molecular mechanism of the indurascent focus of spinal tuberculosis. Methods Measured the mean optical density and percent of positive area of OPG and OPGL in the different group by means of PV-6000 two-step immunochemistry technique，while analyzed correlation between their expression and the mean CT value. Results Ratio of expression of OPG and OPGL and the mean CT value was direct correlation. Conclusion The dynamic unbalance of expression of OPG and OPGL led to the creation of ossified bone in spinal tuberculosis.�
【Key words】
Spinal tuberculosis; OPG; OPGL; Immunohistochemistry; CT
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作者单位：221002徐州医学院附属医院(何玉泽);宁夏医科大学附属医院(王自立 马腾)
对于脊柱结核病变周边椎骨硬化的认识，一方面，认为是机体自身免疫损伤修复的形态学改变，有利于局部病灶与周边正常椎体结构的隔绝，避免结核杆菌向远处扩散而导致进一步的结核性病理损害。另一方面，认为也是病变结构和抗痨药物的屏障，阻碍了抗结核药物的进入，为结核杆菌的残存提供了场所。脊柱结核椎骨硬化主要在CT影像显示最清晰，表现为高密度区域，这些区域在手术过程中显示为非常坚硬的骨质(硬化骨)，使传统的病灶刮除术不能把结核病灶彻底清除，这样术后复发率较高，但有关硬化骨产生机制的研究还鲜见报道。�
1 资料与方法�
1.1 一般材料�
1.1.1 标本采集与分组 取脊柱结核患者术中切除的骨质,按照部位分为3组,紧挨病灶空洞壁的硬化骨质,切除少量正常骨质作为正常组,位于硬化骨和正常骨之间的部分组成亚正常骨组。�
1.1.2 主要免疫组化试剂 PV-6000二步法免疫组织化学染色试剂盒购自河北博海生物工程开发有限公司,抗OPG和抗OPGL抗体均为兔抗人多克隆抗体,工作浓度均为1�∶�100。�
1.2 方法�
1.2.1 OPG和OPGL免疫组化染色(PV-6000二步法): 4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定、10%EDTA脱钙液脱钙后的病灶骨组织标本进行常规石蜡包埋、切片，组织切片用二甲苯脱蜡，用梯度乙醇脱水，蒸馏水洗涤。采用高热高压抗原修复。每张切片加入3%H��2�O��2�去离子水，以阻断内源性过氧化物酶，防止标本中的内源性过氧化物酶使DAB发生显色发应，产生非特异性染色。每张切片分别滴加OPG或OPGL第一抗体(OPG、OPGL兔抗人多克隆抗体，工作浓度均为1�∶�100)，第一抗体会与组织中的OPG、OPGL发生特异性结合。每张切片分别滴加试剂A(post-blocking)和试剂B(Poly-HRP Antl Ms/Rb IgG)，第二抗体将与第一抗体发生特异性结合。滴加新鲜配制的DAB显色剂，此时过氧化物酶催化3,3-二氨基联苯胺与双氧水发生反应，产生棕黄色沉淀物。显色充分后蒸馏水冲洗终止显色反应。复染、脱水、透明、吹干、封片，镜下观察结果。�
1.2.2 免疫组化染色结果的分析和处理
根据免疫组化染色判定标准［1］以细胞浆、细胞膜以及基质中出现棕黄色颗粒为阳性表达，以PBS磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。将免疫组化切片置于OLYMPUS显微镜下观察，利用OLYMPUS BX40病理图文报告系统在每张切片随机选取5个不相重复的视野采集图像，并将图像输入Image Pro Plus6.0(IPP6.0)图像分析系统，对染色强度进行半定量分析，测定OPG和OPGL免疫组化染色平均光密度和阳性面积比，取每张切片的均值作为该例的测量值。�
1.2.3 CT值的测定
根据患者术前检查的CT用骨窗对病灶部位进行观察，采用美国GE Lightspeed 16排螺旋CT机，扫描厚度为5 mm，间距5 mm。采用Advantage Workstation 4.3后处理工作站，在硬化壁中心层面随机取4个区域，测量兴趣区(ROI)1.0 mm��2�严格一致，测其CT值，求其平均值作为该病例该部位的CT值，同样在正常骨质和亚正常骨质也各取4个点，求其平均值作为该部位的CT值［2］。�
1.2.4 统计学方法
利用SPSS 11.5统计软件包对数据结果进行统计学分析，计量资料数据结果用均数±标准差(x±s)表示。各组间平均CT值的比较以及各组间OPG和OPGL免疫组化染色阳性指标的比较采用单因素方差分析。各指标间相关关系的分析采用Pearson相关分析。P0.05)，(见表1)。�
表1
各组平均CT值(x±s,HU)
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分组例数CT值
硬化骨组29475.94±42.99
亚正常组38209.06±36.51
正常骨组38180.63±31.95
2.2 各组OPG和OPGL表达比值的比较
分析结果显示硬化骨组OPG平均光密度和OPGL平均光密度的比值，明显高于其他两组，差异有统计学意义(P0.05)。硬化骨组OPG阳性面积比和OPGL阳性面积比的比值，明显高于其他两组，差异有显著统计学意义(P0.05)。(见表2)�
表2
各组OPG和OPGL表达的比值(x±s)
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分组OPG�OPGL�平均光密度OPG�OPGL�阳性面积比
硬化骨组1.413±0.0341.469±0.195
亚正常组1.006±0.0461.001±0.211
正常骨组1.003±0.0320.998±0.229
2.3 各组OPG和OPGL表达比值与平均CT值的相关关系
分析结果显示各组OPG平均光密度和OPGL平均光密度的比值与平均CT值呈正相关关系(P［3］分别发现的一种新的骨代谢因子，又称破骨细胞生成抑制因子。OPG作为骨转换的重要分子生物学指标，在骨吸收中对破骨细胞有抑制作用，抑制骨吸收，增加骨量，最终使骨组织病理形态向硬化型方向发展。骨保护蛋白配体(OPGL)是Yasuda等［4］从成骨细胞/基质细胞上克隆得到的另一种骨代谢因子，又名破骨细胞核因子受体活化因子配基(RANKL)，对破骨细胞的分化、活化，抑制破骨细胞凋亡起重要作用［5,6］。OPGL是目前发现的惟一能直接诱导破骨细胞分化发育并参与破骨细胞功能调节的细胞因子，OPGL还可增强破骨细胞运动能力并抑制破骨细胞的凋亡来间接促进其骨吸收功能［7］。�
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图2
硬化骨组OPG/OPGL阳性面积比与�平均CT值的相关性散点图
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骨的正常代谢是维持骨质吸收和骨质形成的平衡过程，破骨细胞活性和分化的调节对于维持这一平衡起决定作用［8-10］，OPG/OPGL/RANK环路是调节骨代谢的核心因子，OPG是OPGL的可溶性诱饵受体，竞争性地结合RANK，抑制OPGL与RANK之间的信号传递，从而抑制破骨细胞成熟与激活，达到骨吸收和骨形成的动态平衡。多种激素和细胞因子调节OPG和OPGL的表达，文献报道［11］影响OPG-RANKL表达的因素有很多，细菌，机械刺激、张应力、压应力、激素、甲状旁腺激素、1,25(OH)��2�D��3�、细胞因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、免疫应答等等。骨质的破坏，启动了机体的修复机制，各种影响骨转换的因子分泌增加，功能增强，使骨转换速度加快，一方面促进了成骨过程，对破坏的骨质进行修复；另一方面也促进了破骨过程，对修复的骨质进行塑形和重建。脊柱结核起病缓慢，病史较长，上述因子都有可能在脊柱结核病灶修复过程中发挥作用，影响OPG-RANKL的表达，骨质修复也是在很长的时间内完成的，而且经常反反复复，破坏、修复、骨化，然后再破坏、修复、骨化，由于坏死灶周围骨质硬化过程不一定是同时进行的，有的地方已经骨质硬化，有的地方没有硬化，当机体局部抵抗力降低或化疗不规律、结核杆菌产生耐药时，结核菌又开始繁殖增长，坏死灶就会向相对比较薄弱的未硬化的部分扩散，甚至到达硬化部位的两侧和外面，从而形成结核病灶的不规则形状。与上述脊柱结核病理过程相对应，影像学上也表现为不规则，C T表现为不规则的骨质破坏，本组骨质破坏的显示率为100％，有时同一病例不同的病灶处表现为多种骨破坏改变，也提示脊柱结核慢性、反复的发病过程。�
本实验研究发现，脊柱结核硬化骨组织中OPG和OPGL表达水平的比值较亚正常骨组和正常骨组显著升高，差异有统计学意义(P0.05)，提示硬化骨组OPG表达的强度超过了OPGL表达的强度；并且各组OPG和OPGL表达水平的比值和平均CT值均呈正相关关系，说明随着OPG/OPGL的增高平均CT值亦增高。提示在脊柱结核免疫炎症反应刺激下，在影响OPG-RANKL表达的因素［11］细菌，机械刺激、免疫应答等参与下，可通过提高OPG/OPGL表达而抑制破骨细胞前体细胞的发育、活化和生存，抑制破骨活动，增加骨量，骨密度增高，使骨组织形态向硬化型方向发展，影像学上表现为CT值增高。有文献报道［7］ OPG和OPGL是作用于骨吸收和钙代谢的最后体液介质，OPG和OPGL表达的比例决定骨吸收的程度，推测可能在脊柱结核的骨转换加速过程中OPG和OPGL等细胞因子联合发挥重要作用，即有成骨活动增强，也有破骨活动增强，只是可能由于成骨活动增强的程度强于破骨活动增强的程度。在脊柱结核骨组织微环境中，免疫反应及炎性介质可能通过刺激成骨细胞分泌OPG增加超过了OPGL的增加，从而通过一系列的级联反应，最终导致破骨细胞功能受到抑制，骨吸收活动减弱，而造成了脊柱结核骨质呈硬化型的病理表现。由于硬化骨非常致密，它不但影响抗结核药物的渗透，而且为结核菌的残留提供了场所，是脊柱结核复发的最主要原因之一［12］。因此手术必须用骨刀彻底清除病灶及其周围硬化骨，直到正常骨，局部的OPG和OPGL表达比例又会恢复动态平衡，有利于病灶的愈合。病灶的愈合消除了细菌、炎症介质、免疫应答等促使OPG和OPGL表达比例失调的因素，从而使骨吸收与骨形成维持正常的动态平衡。�
脊柱结核的各种病理表现都是骨吸收与骨形成正常动态平衡的破坏，即病理情况下产生的多种因子调控OPG和OPGL表达的动态不平衡导致了脊柱结核病灶周围硬化骨的产生。但究竟是如何调控的，明确而具体的发生机制等相关问题的阐明尚有待于更深入的研究。�
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