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【摘要】 目的 检测促血管生成素-2(Ang-2)在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达,研究它与血管内皮生长因子（VEGF）表达及微血管密度(MVD)的关系,探讨其在非小细胞肺癌血管生成中的作用。方法 用免疫组化法检测37例非小细胞肺癌组织及15例癌旁正常组织中Ang-2、VEGF及CD34相关抗原的蛋白表达情况,分析各个指标在各组表达的差异，研究各个指标的相互关系。结果 非小细胞肺癌组织中Ang-2 表达阳性率、VEGF记分和微血管密度计数(MVD)均明显高于癌旁正常组织; Ang-2表达与VEGF和MVD表达有明显相关性(r分别0.509和0．615,P[１],主要作用是维持血管内皮细胞稳定及促进血管重构，其在肿瘤血管新生过程中作用显著。近来研究发现，Ang-2的促进肿瘤血管生成作用可能与VEGF因子的表达密切相关。为此我们应用免疫组化的方法，检测Ang-2、VEGF在非小细胞肺癌(NSCLC)及相应癌旁正常组织表达情况，探讨Ang-2于肿瘤血管生成的关系。
1 材料与方法
1．1 标本及试剂 采用郑州大学第二附属医院2006年10月至2007年6月非小细胞肺癌手术切除标本37例, 患者术前均未经放疗及化疗。本组男20例,女17例，年龄44～71岁,平均（57．76±7．01）岁，＜60岁24例, ≥60岁13例。经病理证实为鳞状细胞癌21例,腺癌16例。有肺门、纵膈淋巴结转移23例，无淋巴结转移14例；TNM分期 ：Ⅰ期14例、Ⅱ期16例、Ⅲa期7例。同时随机选取其中癌旁5 cm以远正常无明显炎症肺组织15例为正常对照。所有标本均经体积分数10%中性缓冲福尔马林固定,石蜡包埋,切片处理。主要试剂兔抗人Ang-2、兔抗人VEGF抗体、兔抗人CD34单抗、免疫组化SABC试剂盒DAB显色试剂盒均购自武汉博士德公司。
1．2 方法 采用免疫组织化学SABC法，常规脱蜡，水化；3％ H2O2 -甲醇消化内源性过氧化物酶；煮沸修复抗原；10 %山羊血清封闭；一抗(均为1∶100)4℃ 冰箱培育过夜；二抗、SABC反应各20 min(1：100，20～ 37℃)；DAB镜下控制染色，水冲10 min；核复染；脱水、透明、封片、观察。每一步骤间均用磷酸盐缓冲液(pH7．4、0．01 mol／L PBS)冲洗3～4次，每次3～5 min。阳性对照为人结肠癌，阴性对照以PBS代替一抗。
1．3 免疫组化结果判定 参照Tanaka F等的方法进行[2]。Ang-2染色阳性细胞以细胞质出现棕黄色颗粒为准,连续观察10个视野，以平均每视野阳性细胞数大于5％为阳性。VEGF染色以细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性：阳性细胞数(a):0分为无阳性细胞,1分为阳性细胞数50%。染色强度(b):0分为无染色,1分为弱染色,2分为中等强度染色,3分为强染色。以a+b之和为VEGF得分。0～3分为弱表达，3分以上为强表达。
1．4 CD34标记的微血管密度（microvessel density MVD）计数: 参照Weidner方法进行[3]。先在低倍镜下(100×)全面观察切片,寻找高血管密度区,即所谓的“热点”,然后在高倍镜(400×)以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分有明显区别的任何一个染色阳性的内皮细胞或细胞丛作为一个微血管,记录5个视野内的微血管数,取其平均值。
1．5 统计学处理 所有统计处理均在SPSS10．0统计软件包中完成 ,以P0．05)。而淋巴结转移阳性者明显高于淋巴结转移阴性者, 差异均有统计学意义 (P0．05）。
4 讨论
微血管形成与肿瘤的生物学行为关系密切，研究表明,当肿瘤的体积超过2 mm3，若要继续生长，必须依赖于新血管的生成。血管生成素家族是在血管生成过程中起重要作用的蛋白质家族[4],主要作用是维持血管内皮细胞稳定及促进血管重构,它包括Ang-1、Ang-2, Ang-3、Ang-4四个成员。其中尤以Ang-2在肿瘤血管新生过程中作用最为显著，其可启动肿瘤早期形成信号，通过竞争性抑制Ang-1,降低血管内皮细胞稳定性，促进不稳定渗漏性的新生血管形成[8]。本实验应用免疫组化的方法，对NSCLC组织及癌旁正常组织的Ang-2表达进行研究，结果显示：Ang-2蛋白表达在NSCLC组织中明显高于癌旁正常组织，其差异有显著性。提示Ang-2与NSCLC的发生有关。有淋巴结转移的NSCLC中，Ang-2表达率明显高于无淋巴结转移者；TNM分期中Ⅲ期的NSCLC中Ang-2表达率高于Ⅱ期. Ⅱ期高于Ⅰ期，提示NSCLC中Ang-2高表达与淋巴结转移和TNM分期密切相关。由上可推测，NSCLC中Ang-2的高表达对评价肿瘤的发生、发展有一定的价值。
新生血管形成受到多种细胞因子的调节，VEGF及其受体系统和Ang及其受体Tie-2系统是调节肿瘤而管生成的两条重要途径。研究发现，Ang-2和VEGF在肿瘤血管生成中的起着协同作用。Ogawa等的研究表明，结肠癌的肝转移癌灶中Ang-2和VEGF共同促进了肿瘤性新生血管的形成[5]。本实验在研究Ang-2 表达对非小细胞肺癌VEGF表达与MVD值的关系时发现，Ang-2阳性组VEGF免疫组化记分及MVD值均高于阴性组，Ang-2表达于VEGF表达及MVD计数呈正相关。在双因素分析Ang-2、VEGF共同表达对MVD值的作用时发现:当VEGF弱表达（0～3分）时，Ang-2阳性和阴性表达组的MVD值在统计学上没有显著性差异；当VEGF强表达（4～6分），Ang-2阳性和阴性表达组的MVD值的MVD值有显著性差异，Ang-2阳性表达组的MVD计分明显高于阴性表达组； VEGF强表达并且Ang-2阳性组的MVD值最大。结果显示了Ang-2对非小细胞肺癌血管生成的作用具有VEGF依赖性:即在VEGF存在时，Ang-2与VEGF共同促进了肿瘤的血管生成，在VEGF缺乏时，Ang-2对肿瘤血管生成的作用不大。我们推测，Ang-2血管生成的VEGF依赖性机制可能为：①VEGF可能通过某种途径（如增加Ang-2受体的数量或增强Ang-2受体的敏感性、拮抗Ang-2天然拮抗剂Ang-1的作用）来增强Ang-2的促血管生成作用，当VEGF低表达时，这一作用明显受到抑制 。②Ang-2作用主要为促进形成不稳定渗漏性的新生血管。当VEGF高度表达时，VEGF可以特异性地作用于那些不稳定血管的内皮细胞，促使其分裂和产生趋化作用，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，使肿瘤血管进一步成熟及稳定；当VEGF弱表达时，不稳定渗漏性的新生血管大量发生退化，新生血管数目减少。
综上所述，Ang-2与肿瘤的生长、转移、进展密切相关。Ang-2、VEGF 对肿瘤血管生成有协同作用，促进肿瘤新生血管的产生。Ang-2对非小细胞肺癌血管生成的作用具有VEGF依赖性。关于Ang-2及VEGF在血管形成的过程中是怎样相互联系、相互协调和相互作用等领域还不十分清楚，需深入探讨，以作为Ang-2应用提供理论依据。
参考文献
1 Maisonpicrre PC, Su ri C., Jones PF, et al.Angiopoietin-2,a natural antagonist for tie2 that distrupts in vivo angiogenesis Sience,1997,277(5322):55-60.
2 Tanaka F, Ishikawa S, Yanagihara K, et al.Expression of angiopoietins and its clinical significncer in non small cell lung cancer. Cancer Res,2003,62: 7124-7129.
