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【摘 要】目的：研究大孔吸附树脂分离纯化鱼腥草总黄酮工艺，为鱼腥草总黄酮的工业化生产提供实验依据。方法：以贵州产鱼腥草为原料，以鱼腥草总黄酮含量及回收率等为考察指标，选用大孔吸附树脂对鱼腥草总黄酮进行分离纯化，分别采用静态试验、动态试验等考察大孔树脂对鱼腥草总黄酮的分离纯化效果及影响因素。结果：AB－8型大孔吸附树脂对鱼腥草总黄酮静态饱和吸附量为76．20mg．g－1（干树脂），洗脱率97．35％，动态饱和吸附量为74．5mg．g－1（干树脂），总黄酮回收率在82．8％、纯度在80％以上，是实验树脂中分离纯化鱼腥草总黄酮的最佳大孔吸附树脂。结论：分离纯化鱼腥草总黄酮最佳工艺条件为：AB－8型大孔吸附树脂，洗脱剂为70％乙醇，洗脱剂用量为2～3倍树脂体积，上柱总黄酮量与树脂比为113．4，上柱液总黄酮浓度为17．57mg．mL－1，流速2～3ml．min－1，上柱液pH4～5。
【关键词】：大孔树脂 鱼腥草 总黄酮 分离纯化
【中图分类号】R282．71；R284．2【文献标识码】A【文章编号】1007－8517（2008）08－0007－05
Separation and purification of flavonoids from Houstonian cordata Thunb with macroporous resin
LUO Xian－hua，YU Jian－sheng
Tongren Vocational Institute， Tongren 554300， china
Abstract Objective A method for separation and purification of flavonoids from Houstonian cordata Thunb with macroporous resin was studied， Method By using Houstonian cordata Thunb in Guizhou and with the content and recovery rate of flavonoids as indexes and the static adsorption capacityand the static elution ratio． Result The results are as flollows The static adsorption capacity of AB－8 type resin was 76．20mg／g， the static elution ratio were 97．35％， the dynamic adsorption capacity of AB－8 type resin was 74．5mg／g， the recovery rate is more than 82．8％ and the purity is more than 80％． AB－8 type resin is the best for separating and purificating Houstonian cordata Thunb in flavonoids． Conclusion The optimum conditions is AB－8 type macroporous resin， the eluant is 70％ alcohol and 2～3 times as the volume of the resin， the volume of the resin is 13．4 times of flavonoids in sample，concentration of flavonoids of sample is 17．57mg／mland current velocity of 2～3ml／min，pH value of sample is 4～5．
Key wordsmacroporous resin；Houstonian cordata Thunb；flavonoids；separation；purification
鱼腥草Houstonian cordata Thunb又名侧耳根、臭草、蕺菜，是三白草科蕺菜属多年生草本植物，是一种历史悠久的集营养、保健、药用功能于一体的传统药食两用植物 既可鲜用又可以干用1，2。已被国家卫生部正式确定为“药食两用”的品种之一。在药品、食品、保健用品、保健食品、化妆品等诸多领域极具开发应用价值。鱼腥草广泛分布在我国长江以南诸省，特别是云、贵、川三省资源丰富，并大量进行人工栽培。作为食用，其茎叶和地下根状茎都可以直接当菜食用及生产保健食品，它不仅营养丰富，而且味道鲜美、风味独特。作为药用，其性味辛、寒，具有清热解毒、消肿排脓、利尿涌淋的功效。主要用于治疗肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢热淋、痛肿疮毒等病证1，2。现代医学研究表明鱼腥草的主要活性成分为挥发油和黄酮类化合物，具有较强的抗病毒、抗衰老、抗癌功效1，2，而黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、清热解毒、利尿通便、抗菌消炎、抗氧化衰老、消除体内自由基等药理作用1，2。随着鱼腥草在医药、兽药、保健食品及保健用品领域中的应用越来越广泛，目前国内对鱼腥草总黄酮分离纯化研究尚未见到系统报道。为了开发利用鱼腥草资源，本研究以鱼腥草总黄酮含量及回收率等为考察指标，选用大孔吸附树脂对鱼腥草总黄酮进行分离纯化，分别采用静态试验、动态试验等考察大孔树脂对鱼腥草总黄酮的分离纯化效果及影响因素，研究探讨分离纯化鱼腥草总黄酮的最佳工艺及各种最佳条件因素，从而为生产中最有效的开发利用鱼腥草总黄酮、提高产品质量，进一步综合开发利用鱼腥草资源，为发挥鱼腥草的最大经济效益提供科学依据。
1 仪器与试剂
实验用鱼腥草全草均采自贵州省铜仁市川硐镇同一地点，由本院兽药研究所进行鉴定及采用统一的干燥方法加工制样，避免背景干扰。
所用试剂NaNO2、AlNO33，NaHSO3，NaSO3，EDTA，吐温－80等均为分析纯，乙醇为95％食用酒精，标准品芦丁为美国Sigma公司产品、纯度大于98％；大孔吸附树脂：D3520型，AB－8型，NKA－9型，D4020型，S－8型（南开大学化工厂）。
TU－1800紫外可见分光光度计（北京普析），RE－52旋转蒸发仪（上海亚荣），不锈钢提取锅（武汉立中），PHSJ－3F精密酸度计（上海雷磁），ALG5／10自动灌装封口机（上海国彩），电子天平（美国奥豪斯），恒温水浴箱上海医疗器械厂；鼓风干燥箱上海实验仪器厂；植株样本粉碎机上海实验仪器厂；液体自动混合机（北京长安仪器厂）。
2 方法
2．1 鱼腥草总黄酮的测定方法
鱼腥草总黄酮的测定方法采用芦丁比色法3，测定波长500nm，回归方程：C＝84．327A－0．77365，r＝0．9998，吸光度线性范围：0．1～0．6，加样回收的平均回收率99．47％，RSD1．89％（n＝6）；精密度测定RSD0．95％。
2．2 鱼腥草总黄酮上柱样品液的制备
取鱼腥草干品粗粉500g，根据作者已有经验L9（34）正交设计筛选出的鱼腥草总黄酮的乙醇浸提最优水平组合工艺：即采用70％乙醇、80℃温度、每次3h、提取3次进行提取制备，制得鱼腥草总黄酮提取液（总黄酮含量：6．86mg．mL－1）冷藏备用。
2．3 大孔吸附树脂的筛选4，5，6
将D3520型、AB－8型、NKA－9型、D4020型、S－8型树脂先用4倍体积量95％乙醇或丙酮浸洗数次每次24h，至浸洗液加适量水无白色浑浊现象止，用水反复清洗干净至无醇味，加入4倍体积量2mol．L－1的NaOH，浸泡12h，以水洗至中性；再加入4倍体积量4mol．L－1的HCl，浸泡12h，用水洗至中性后备用。
精密称取已预处理好的干树脂各3份，每份1g，置100mL三角瓶中，精密加入样品液20mL后于电动震荡机上，频率120次／min，间隔振摇2 h，然后静置20h，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按下式计算树脂饱和吸附量：饱和吸附量＝（初始浓度－吸附后浓度）×吸附液体积／树脂量（mg．g－1干树脂），取3次平均值。将经静态饱和吸附总黄酮后树脂滤出，吸干表面水分，精密加入60％乙醇20mL后放于电动震荡机上，频率120次／min，间隔振摇2h后滤出，测定洗脱液黄酮的浓度，计算洗脱率：洗脱率＝（洗脱液浓度×洗脱液体积）／饱和吸附量×100％，取3次平均值。
2．4 洗脱剂浓度对洗脱率的影响
精密称取处理好的AB－8型干树脂七份，每份1g，分别置100mL三角瓶中，精密加入20mL样品液后于电动震荡机上，按2．3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，分离树脂，吸干表面水分。对应加入浓度分别为30％，40％，60％、70％，80％，90％的乙醇20mL后于电动震荡机上，同法间隔振摇洗脱2h后滤出，测洗脱液中总黄酮浓度，按2．3项下公式计算洗脱率，取3次平均值。
2．5 pH对AB－8型树脂吸附量的影响
精密称取已预处理好的AB－8型干树脂各八份，每份1g，置100mL三角瓶中，精密加入pH 3，4，5，6，7，8，9，10样品液各20mL后于电动震荡机上，按2．3项下同法震荡，使其达到饱和吸附，吸取上层液测定总黄酮浓度，按2．3项下公式计算树脂饱和吸附量，取3次平均值。
2．6 AB－8型树脂对鱼腥草总黄酮的动态吸附－洗脱性能试验4
称取已处理好的AB－8型吸附树脂100g和20 g，分别湿法装入3cm×500cm的色谱柱中，将鱼腥草提取液350mL（6．86mg．mL－1）以2～3mL．min－1的流速上柱，过柱完后用3倍树脂体积量（3～4BV，下同）的水以3～4mL．min－1的速度洗柱至出水无色，再用4BV70％的乙醇以2～3mL．min－1的洗脱速度洗脱至无色透明，收集70％的乙醇洗脱液，减压浓缩，干燥，称重，测定总黄酮含量，计算动态吸附洗脱量。
2．7 上柱液浓度对AB－8型树脂动态吸附鱼腥草总黄酮的影响4
分别称取已处理好的AB－8型吸附树脂400g，3份，湿法装入5cm×500cm的层析柱中，取鱼腥草浸膏3份，每份100g（含总黄酮24．6g），分别按2BV（1400mL）、3BV（2100mL）、4BV（2 800mL）加水溶解过滤后上柱，流速2～3mL．min－1，过柱完后分别收集各自的过柱液，测其中总黄酮残留量。
2．8 冲洗杂质用水量对AB－8型树脂动态吸附鱼腥草总黄酮影响
分别称取已处理好的AB－8型吸附树脂400g，湿法装入5cm×500cm的层析柱中，取鱼腥草浸膏2份，每份100g（含总黄酮24．6g），分别按2BV（1400mL）加水溶解过滤后上柱，流速2～3mL．min－1，过柱完后一份不冲洗，一份用1BV水（700mL）冲洗，共冲洗3次，分别测定每份过柱水中总黄酮残留量并计算损失量及考察水冲洗对总黄酮纯度影响。
2．9 洗脱剂洗脱次数对AB－8型树脂动态吸附鱼腥草总黄酮收率影响
称取已处理好的AB－8型吸附树脂400g，湿法装入5cm×500cm的层析柱中，取鱼腥草浸膏100g（含总黄酮24．6g），按2BV（1400mL）加水溶解过滤后上柱，流速2～3mL．min－1，过柱完后用70％乙醇作洗脱剂，按1BV（700mL）洗脱，共洗脱5次，收集每次洗脱剂，测定其中总黄酮含量。
3 结果与分析
3．1 不同吸附树脂对鱼腥草总黄酮的静态吸附量及洗脱性能，结果见表1。
上述结果表明五种树脂对鱼腥草总黄酮的静态吸附量以S－8型稍高，AB－8型次之。在静态洗脱中，AB－8型树脂吸附的总黄酮较易洗脱，洗脱率远远高于其它4种，使总黄酮得到最大程度的回收，AB－8型树脂表现出最佳的综合性能。
3．2 洗脱剂浓度对AB－8型树脂饱和吸附后洗脱率的影响，结果见表2。
表2表明，70％～90％的乙醇洗脱率均在90％以上，考虑到节约成本及生产安全上的方便，本实验选用70％乙醇为洗脱剂。
3．3 pH对AB－8型树脂吸附量的影响，结果见表3。
表3表明，上样液以pH4～5吸附量大。黄酮类化合物多具酚羟基，显弱酸性，当上样液pH偏大时，鱼腥草总黄酮有离子化趋势而不易被吸附。因此，上样液pH值应约偏酸。
3．4 AB－8型树脂对鱼腥草总黄酮的动态吸附－洗脱性能
根据静态试验结果，选用AB－8型树脂作为分离纯化鱼腥草总黄酮用树脂。70％乙醇为洗脱剂，用于鱼腥草总黄酮的动态吸附－洗脱，结果见表4。
表4表明，装柱量为100g的色谱柱总黄酮吸附百分比为98．3％吸附百分比＝（每克树脂吸附量×树脂量）／上样总黄酮量，表明样品液中总黄酮已吸附完全，而每克树脂吸附量为23．6mg，未达饱和。装柱量为20g的色谱柱总黄酮吸附百分比为62．1％，表明未吸附完全；而每克树脂吸附量为74．5mg，吸附量已达饱和。其吸附量74．5mg．g－1（干树脂）即为AB－8型大孔吸附树脂对鱼腥草总黄酮的饱和动态吸附－洗脱量，上柱总黄酮量与树脂比为113．4。
3．5 上柱液浓度对AB－8型大孔吸附树脂吸附鱼腥草总黄酮的影响，结果见表5。
表5表明，上柱液中总黄酮含量相同，而浓度、体积不同（2BV、3BV、4BV）时，对鱼腥草总黄酮吸附量有影响。4BV上柱液体积最大、浓度最低，过柱后残液中总黄酮含量最多，吸附量最低，损失量（未被吸附量）占总黄酮总量的17．96％；而2BV体积上柱液浓度最大，其过柱时间最短，损失量最小为6．59％。由此可见，提高上柱液浓度有利于吸附和节省时间。
3．6 冲洗杂质用水量对AB－8型大孔树脂吸附鱼腥草总黄酮回收率影响，结果见表6。
表6表明，吸附后用水冲洗对已吸附的总黄酮会有一定量的损失，水洗次数越多，损失量越大，水洗3次损失吸附量的17．93％，但水洗可除去杂质，提高总黄酮纯度。
3．7 洗脱剂洗脱次数对AB－8型树脂吸附鱼腥草总黄酮回收率影响，结果见表7。
从表7可看出，总黄酮洗脱量主要集中在第1、2两次，占总黄酮洗脱量的93．85％。洗脱剂用量为2倍树脂体积。
4 结论与讨论
4．1 实验表明，AB－8型大孔吸附树脂对鱼腥草总黄酮有较大静态吸附量，为76．20mg．g－1，洗脱率为97．35％，高于其它4种大孔吸附树脂。同时，其动态吸附－洗脱性能也最好，总黄酮回收率为82．8％。综合考虑各因素，AB－8型大孔吸附树脂为分离纯化鱼腥草总黄酮的最佳树脂。
4．2 在选定树脂后，分别对影响AB－8型树脂吸附、洗脱的因素进行了考察，研究表明：洗脱剂乙醇浓度增高，洗脱率逐渐增大，70～90％的乙醇洗脱率均在90％以上，而乙醇浓度高易挥发，从经济，节约出发选用70％乙醇即可。上样液以pH 4～5时饱和吸附量最大。因黄酮类化合物多具酚羟基，显弱酸性，当上样液pH偏大时，鱼腥草总黄酮有离子化趋势而不易被吸附。因此，上样液pH值偏酸有利于吸附。
4．3 目前，尚未见有大孔吸附树脂分离纯化鱼腥草总黄酮上样浓度的报导，但有报导上样液浓度对吸附量有影响4，7，本研究表明上样液浓度与吸附量呈明显的正相关关系，17．57mg．L－1吸附量明显高于8．79mg．L－1，适当提高上样液浓度有利于吸附。上样液浓度以分离的目标产物鱼腥草总黄酮计，可消除鱼腥草药材产地、品种等不同造成的总黄酮含量的差异，有利于保证吸附及减少损失。
4．4 本研究上样总黄酮量与树脂比为113．4，为保证吸附完全，实际生产中树脂量应大于此比例，以保证达到饱和吸附及吸附完全；样品液上柱流速为2～3mL．min－1；冲洗杂质用水量4BV，上柱流速为3～4mL．min－1；洗脱剂用量2～3BV，上柱流速为2～3mL．min－1，即可达到满意效果，总黄酮纯度达80％、回收率达82．8％。
4．5 随着吸附－洗脱次数的增加，残留在树脂上而不能被洗脱下来杂质会增加，使吸附力减弱或丧失，总黄酮吸附率、纯度等均呈下降趋势。因此使用一段时间后（4～5次），必须对树脂进行再生处理，以保证总黄酮回收率在80％以上、纯度在80％以上。
参考文献
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（收稿日期：2008．6．2）
