【www.zhangdahai.com--德育论文】
【关键词】肝脏;纤维化;肝素;复方丹参 doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.266 文章编号:1006-1959(2010)-05-1270-02
1.实验动物
Wistar雄性大鼠共61只,体重250～350g,购自山东省卫生防疫站。普通杆状饲料喂养,自由进水。大鼠随机分为6组,(见表1)。
表1 大鼠分组及药物干预治疗
组别名称药物干预治疗
1正常对照组(N)皮下注射生理盐水,3.0ml/kg
2肝纤维化大鼠组(F)皮下注射40%CCl4花生油溶液,3.0ml/kg
3肝素治疗组1皮下注射40%CCl4花生油溶液21天后,开始同时给予肝素,剂量为0.83mg/kg
4肝素治疗组2皮下注射40%CCl4花生油溶液21天后,开始同时给予肝素,剂量为0.42mg/kg
5复方丹参治疗组1皮下注射40%CCl4花生油溶液21天后,开始同时给予复方丹参,剂量为0.67ml/60kg
6复方丹参治疗组2皮下注射40%CCl4花生油溶液21天后,开始同时给予复方丹参,剂量为0.34ml/kg
2.方法
造模后8周,处死大鼠。留取血清检测透明质酸(HA)、III型前胶原(PCIII)、层连蛋白(LN)、IV型胶原(IV-C)水平。同时留取肝组织进行组织学观察。
2.1 血清学指标检测。
2.1.1 血清HA、PCIII、LN、IV-C的检测:均采用放射免疫法。试剂盒购自上海海军医学研究所。用GC-911型放射免疫伽玛计数器进行检测。严格按照说明书操作。
2.1.2 血清TGF-β1水平的检测:采用ELISA法。试剂盒为美国Sigma公司生产。用荷兰产Multiskan Ms型酶标仪进行检测。严格按照说明书操作。
2.2 光镜观察:将肝组织用福尔马林固定,石蜡包埋切片,HE染色,Masson三色染色,观察。依据2000年西安全国肝病会议通过的纤维化分期标准[2],将纤维化程度分为S0、S1、S2、S3、S4五期。
肝组织连续切片同时进行TGF-β1、PC-III的免疫过氧化物酶染色。TGF-β1单抗购自武汉博士德生物工程有限公司,PC-III单抗购自美国Rockland公司。免疫过氧化物酶染色采用SABC法。SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。简要步骤如下:①石蜡切片常规脱蜡至水;②3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性;③滴加复合消化液;④滴加内源性生物素封闭剂以减少背景染色;⑤正常山羊血清封闭;⑥滴加一抗(TGF-β1、PC-III的抗体以1:100稀释),湿盒中4℃过夜;⑦次日滴加生物素化羊抗小鼠/兔IgG,37℃作用20分钟;⑧滴加SABC,37℃作用20分钟;⑨DAB显色,显微镜下控制反应时间;⑩苏木素轻度复染,盐酸酒精分色,逐级酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。阳性表达的判别依据为细胞浆中有棕黄色颗粒沉积。
2.3 统计学处理:各组间血清学指标水平的比较应用t检验,P〈0.05被认为有统计学意义。各组间肝脏组织学纤维化分期的比较应用秩和检验,P〈0.05被认为有统计学意义。
3.结果
3.1 大鼠外观形态改变:正常对照组大鼠毛色洁白光滑,光泽自然柔和,反应灵敏。肝纤维化大鼠组皮下注射40%CCl4花生油溶液后,约一个月即出现毛色变黄,色泽黯淡,随着注射40%CCl4花生油溶液时间延长,大鼠逐渐消瘦,尿液变黄,精神不振,反应变迟钝。
3.2 血清学指标的检测:(见表2)。
3.2.1血清HA、PC-III、LN、IV-C水平的比较:肝纤维化大鼠造模组的各项血清学指标水平与正常对照组相比均有极显著性差异(P0.05)。
高剂量与低剂量肝素治疗组的各项血清学指标水平与肝纤维化大鼠造模组相比均有极显著性差异(P0.05)。
高剂量与低剂量复方丹参治疗组的HA、IV-C、PC-III和LN水平与肝纤维化大鼠造模组相比均有显著性差异(P0.05)。
高剂量与低剂量肝素治疗组的HA、IV-C、PCIII、LN水平均较复方丹参治疗组为低。高剂量肝素治疗组的HA、IV-C、LN水平与高剂量复方丹参治疗组相比有显著性差异(P0.05)。
3.2.2 血清TGF-β1水平的比较:各组与正常对照组相比,血清TGF-β1水平显著升高(P0.05)。
表2 各组大鼠血清学指标检测结果(X±S)
组别例数HA(ng/ml)PCⅢ(ng/ml)LN(ng/ml)IV-C(ng/ml)TGF-β1(μg/ml)
N12144.44±25.719.03±0.9130.22±5.152.50±0.5985.61±9.78
F10381.97±54.9217.86±1.5462.98±4.915.96±0.99163.97±9.45
肝素19194.59±46.8311.19±1.2238.36±4.693.36±0.79105.54±12.89
肝素210218.63±54.9811.90±1.2140.75±5.723.69±0.97110.38±14.64
丹参111239.63±40.332.17±0.7053.66±3.714.12±0.68132.45±11.61
丹参29288.18±60.1612.72±1.1455.88±5.004.67±0.79143.15±11.71
3.3 光镜观察。
3.3.1 HE染色:正常对照组大鼠肝细胞板呈条索状,以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列,肝窦腔通畅,汇管区无炎细胞浸润,无胶原纤维增生。
肝纤维化大鼠造模组肝脏正常的肝小叶结构丧失,肝内血管结构紊乱。肝细胞变性、坏死重,见碎屑坏死、桥接坏死。汇管区大量炎细胞浸润。典型的假小叶形成,说明肝纤维化造模成功。
肝素治疗组肝小叶结构正常存在,有的肝窦腔内有淤血现象,无明显血栓形成。肝细胞轻度肿胀。汇管区少量炎细胞浸润,有少量胶原纤维沉积。
复方丹参治疗组肝小叶结构尚正常,有的肝窦腔内有淤血现象,较肝素组明显,无明显血栓形成。肝细胞轻度至中度肿胀,可见嗜酸小体。汇管区有较多炎细胞浸润,胶原纤维轻度至中度增生。
图1 正常大鼠肝脏,Masson三色染色。
图2 肝纤维化大鼠肝脏,Masson三色染色。
图3 肝素治疗组大鼠肝脏,Masson三色染色。
图4 复方丹参治疗组大鼠肝脏,Masson三色染色。
图5 正常大鼠肝脏,TGF-β1免疫组织化学染色。
图6 肝纤维化大鼠肝脏,TGF-β1免疫组织化学染色。
图7 肝素治疗组大鼠肝脏,TGF-β1免疫组织化学染色。
图8 复方丹参治疗组大鼠肝脏,TGF-β1免疫组织学染色。
3.3.2 Masson三色染色:正常对照组大鼠肝小叶结构清晰,无胶原纤维增生。
肝纤维化大鼠造模组肝脏正常的肝小叶结构丧失,汇管区大量胶原纤维增生,分割肝组织,形成典型的假小叶,说明肝纤维化造模成功。
肝素治疗组肝小叶结构正常存在,胶原纤维轻度增生。
复方丹参治疗组肝小叶结构尚正常,胶原纤维轻度至中度增生,有的可见纤维隔形成。
表3 各组大鼠肝纤维化分期
组别例数S�0S�1S�2S�3S�4
N12111000
F1000235
肝素1917100
肝素21018100
丹参11105510
丹参2903510
(如表3)所示,肝素、复方丹参各治疗组肝纤维化程度均较单纯肝纤维化造模组为低(P0.05)。
3.4 免疫组织化学染色。按显色程度分弱、中、强3种,分别用+、++、+++表示。按显色范围占肝脏的比例分为:①+:显色范围占肝脏3/4。将显色程度和显色范围换算成显色指数:显色指数=显色程度×显色范围(+为1、++为2、+++为3、++++为4)[3]。
(如表4)所示,由各组免疫组化显色指数可见,正常对照组TGF-β1、PC-III表达轻微。单纯肝纤维化造模组TGF-β1、PC-III显著表达。肝素治疗组肝组织TGF-β1、PC-III的表达较小剂量复方丹参组为轻(P
