[抗人干扰素α2b单克隆抗体制备及初步鉴定]单克隆抗体药物有哪些

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　　【摘 要】 本研究以重组人干扰素α2b蛋白免疫巴比西小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术，获得3株可稳定分泌抗人干扰素α2b单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1E8、1E10和4E4。ELISA鉴定结果表明，3株单抗的亚型均为IgG1，腹水效价都在10-6以上。免疫印迹鉴定结果证实，3株单抗均可与原核表达的人干扰素α2b发生特异性反应。结果表明，本研究成功获得3株针对人干扰素α2b的特异性杂交瘤细胞株。
　　【关键词】 重组人干扰素α2b；单抗
　　
　　干扰素分为Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN[1]。干扰素α2b属于Ⅰ型干扰素[2]，它具有广谱抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。干扰素与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内繁殖，提高免疫功能包括增强巨噬细胞的吞噬功能，增强淋巴细胞对靶细胞的细胞毒性和天然杀伤性细胞的功能[3]。本研究采用重组人干扰素α2b为免疫蛋白，制备抗人干扰素α2b 单抗并对其生物学特性进行鉴定，为深入研究人干扰素α2b检测试剂盒提供物质材料。
　　1 材料
　　重组人干扰素α2b：哈药生物提供；胎牛血清，1640培养基，HT， HAT，聚乙二醇：Sigma公司；鼠源单抗亚类试剂盒：SouthernBiotech；其余生化试剂均为分析纯。
　　2 方法
　　2.1 动物免疫
　　按照萨姆布鲁克J等[4]报道的方法，将重组人干扰素α2b作为免疫蛋白。以1μg/μL的浓度，对6只7周龄巴比西小鼠进行免疫，每只接种100μL，间隔2周免疫一次，共3次，细胞融合于最后一次免疫后7天进行。
　　2.2 ELISA方法的建立
　　以重组人干扰素α2b蛋白为抗原包被ELISA板，用碳酸盐缓冲液稀释抗原，方阵法确定蛋白最佳包被浓度和阴阳性血清的最佳稀释倍数，经HRP标记的山羊抗鼠IgG作用，邻苯二胺底物显色，判定结果。判定标准为阳性血清孔的OD492值接近1.0，阴性血清OD492值＜0.2，P/N≥2.1。
　　2.3 细胞融合及筛选
　　抗血清效价检测于第3次免疫后7天进行。取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，按常规方法进行融合，HAT筛选融合细胞，采用有限稀释法对阳性克隆进行筛选，达到100%阳性者扩大培养，建株保存。
　　2.4 单抗亚类鉴定
　　按SouthernBiotech公司亚类试剂盒说明书用ELISA方法进行检测。
　　2.5 腹水制备
　　采用体内诱生腹水法，按常规方法制备腹水。用建立的ELISA检测方法测定单抗腹水效价，以P/N≥2.0的抗体最大稀释度作为效价终值。
　　2.6 抗体识别特异性鉴定
　　用三株杂交瘤细胞腹水纯化后蛋白做免疫印迹，结果证实本试验所获得的单抗均能与重组人干扰素α2b反应，说明筛选得到的单抗可以特异性识别人干扰素α2b，进一步证实了所获得单抗的特异性。
　　2.7 杂交瘤细胞稳定性分析
　　 对已获得的3株杂交瘤细胞进行30次传代，以免疫鼠血清为阳性对照，以空白鼠血清为阴性对照，收集细胞培养上清液并测其效价。
　　3 结果
　　3.1 间接ELISA方法结果
　　将重组人干扰素α2b原液，分别以8 g/ml，4g/ml，2g/ml和1g/ml的浓度包被ELISA板，阳性和阴性血清稀释倍数为1:100、1:500、1:1000，结果显示，抗原浓度在4μg/ml，血清稀释倍数为1/1000时，P/N≥2.1。
　　3.2 杂交瘤细胞的融合率
　　本试验经过3次细胞融合，细胞的融合率达到了87.65 %，阳性孔率为0.3 %。
　　3.3 细胞株的建立
　　细胞融合后，判定为阳性的杂交瘤细胞经3次克隆筛选，获得3株能够稳定分泌抗人干扰素α2b单抗细胞株，分别命名为1E8、1E10和4E4。
　　3.4 单抗亚类鉴定
　　经单克隆抗体亚类鉴定试剂盒检测，所获3株杂交瘤细胞，均为IgG1型，且都是K轻链抗体。
　　3.5 单抗腹水效价测定
　　经鉴定表明3株单抗1E8、1E10和4E4腹水的间接ELSIA效价都在10-6。
　　3.6 单抗特异性鉴定（图1）
　　经SDS-PAGE电泳后，将转移至硝酸纤维素膜的蛋白进行单抗孵育。结果显示3株单抗均能特异性的识别人干扰素α2b。
　　1 2 3
　　
　　图1 免疫印迹分析
　　1：2：3：人干扰素α2b的纯化蛋白
　　3.7细胞分泌抗体稳定性分析结果
　　由图2可知，杂交瘤细胞株经30次传代，能持续并稳定分泌抗体。
　　
　　图2 细胞株稳定性分析
　　4 讨论
　　本研究以重组人干扰素α2b为免疫原，免疫巴比西小鼠，获得三株抗人干扰素α2b单抗，分别命名为1E8、1E10和4E4。经鉴定，三株单抗亚类均为IgG1，轻链为K链；杂交瘤细胞连续传代30次，其分泌抗体的能力较稳定；腹水效价均达到10-6以上；免疫印迹实验表明, 三株单抗均能够特异性识别人干扰素α2b。
　　目前用于病毒性疾病及肿瘤治疗的干扰素主要有干扰素αlb，干扰素α2a及干扰素α2b亚型，干扰素α2b因其副作用小，疗效高，而更为广泛应用[5]。因此干扰素α2b的检测和试剂盒的开发尤显重要。鉴于此我们研究并制备了人干扰素α2b单抗，从而为人干扰素α2b及其单抗为基础的相关性研究提供物质基础, 也可用于α 型干扰素的结构与功能研究。
　　
　　
　　参考文献
　　[1] 徐韵,余东游,李卫芬.I型干扰素诱生机理的研究进展[J].中国预防兽医学报,2010(10),824-828.
　　[2] 凌云,张申英,张欣欣.I型干扰素不同亚型的产生和抗病毒作用研究进展[J].国际流行病学传染病学杂志,2006年,10月:第33卷第5期.
　　[3] 金伯泉.细胞和分子免疫学[M].北京:科学出版社,2001,183-194.
　　[4] 萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW(黄培堂,等译).分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社，2002,1474- 1480.
　　[5] 宋礼华 杨玲 杜贤宇 王荣海 傅永标.抗重组人干扰素-α2b单克隆抗体的制备与应用[J]上海免疫学杂志，1998年01期.
　　

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