【www.zhangdahai.com--教学论文】
陈 国 龚一富
（1.浙江省慈溪中学 浙江宁波 315300）
（2.宁波大学海洋学院 浙江宁波 315832）
PCR技术是生物学考试中的热点与难点。近年来，随着PCR技术的快速发展，除常规PCR外，还衍生出了重叠延伸PCR、反向PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、不对称PCR、多重PCR等技术，不同的PCR技术有着不同的应用。下文选取了教学中与PCR技术相关的疑难点，并结合典型试题，探讨几种PCR技术的应用，以促进学生对PCR技术的理解，并为教师的教学提供参考。
获取目的基因是基因工程操作的第一步。新版高中生物学教材介绍了化学合成、借助载体建立基因文库和通过PCR扩增DNA三种获取目的基因的方法。由于PCR是体外的DNA扩增技术，部分学生在学习时，对如何利用PCR技术获取目的基因存在疑问。
【例1】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1A所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，如图1B所示，其中第⑤种DNA分子有（ ）个。
图1 目的基因及PCR产物
参考答案：8
难点分析：若要获得目的基因X，至少需要3轮PCR，具体过程如图2所示。第一轮PCR得到2个DNA片段（①和②各一分子）。第二轮PCR得到4个DNA片段（①②③④各一个）。第三轮PCR得到8个DNA片段（①②各1个，③④⑤各2个），其中⑤是等长的，即获得2个目的基因X。同理，第四轮PCR可得到16个DNA片段，其中8个⑤，实现了目的基因的扩增。
图2 PCR获取目的基因
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤。新版高中生物学教材介绍了借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
【例2】为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图3中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是____。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是______________。
图3 重组质粒
参考答案：乙和丙 目的基因反向连接
难点分析：可以运用PCR技术检测鉴定受体细胞中是否转入目的基因，其简要的步骤是，首先根据目的基因的序列设计PCR引物，接着利用待检DNA为模板进行PCR，再通过电泳鉴定PCR产物。如图3所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350 bp片段，反向连接则不会出现；
同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450 bp片段。根据图3中B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400 bp片段。
随着PCR技术的不断创新，在实验中，可利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变，重叠延伸PCR技术是如何将两个不同来源的DNA片段拼接的，也是学生普遍关心的问题。下面结合例题进行分析。
【例3】水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图4所示。
图4 PCR定点突变示意图
（1）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为_____才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为______（假设引物为单链DNA）。
（2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生__________种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_________________。
（3）利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是___________________________。
参考答案：（1）T-A或C-G A或G （2）3引物2和引物3中存在互补片段，置于同一反应体系时会发生结合而失去作用 （3）M1、M2中的一种引物与引物N1、N2的其中一种必须具有互补配对的片段
难点分析：利用重叠延伸PCR技术实现基因定点突变的设计思路分为两步。第一步是重叠，即用具有互补配对片段的引物（图4中的引物2和3）分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，对应图4中的第一阶段；
第二步是延伸，即在后续的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的定点突变的基因，对应图4中的第二阶段。
应用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。如果未知序列的内侧是已知序列，可否利用PCR技术扩增外侧的未知基因序列呢？下面结合例题进行分析。
【例4】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图5（以EcoRⅠ酶切为例）。
图5 反向PCR示意图
请据图5回答问题。
（1）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的引物必须是_______（从表2引物①②③④中选择，填编号）。
表2 DNA序列
（2）对产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是_______。
A.5′-AACTATGCG——AGCCCTT-3′
B.5′-AATTCCATG——CTGAATT-3′
C.5′-GCAATGCGT——TCGGGAA-3′
D.5′-TTGATACGC——CGAGTAC-3′
参考答案：（1）②④ （2）B
难点分析：由于已知序列的外侧是未知序列（如图5中待扩增的未知序列），因此无法设计引物。若要分析出已知序列两侧的未知序列，设计引物是关键，可以采用反向PCR技术。反向PCR的操作步骤可以分为两步。第一步是连接成环，即用限制酶切割DNA，用DNA连接酶将其连接成环，即图5中Ⅰ酶切和Ⅱ连接过程。第二步是反向扩增，即根据已知序列设计一对引物，以环状DNA两条链为模板，从已知序列向未知序列方向进行反向扩增，利用TaqDNA聚合酶无法将DNA连接成环的特点，得到链状DNA，即图5中Ⅲ扩增过程。本题（1）采用反向PCR扩增未知序列，又因子链的延伸方向从5′-3′，可根据已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和 3′-CGTTACGCATC⁃GGAGA-5′，设计对应PCR引物是5′-TCATGAGCG⁃CATAGTT-3′和 5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，本题（2）对产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的两端，所以5′端应该是AATTC，对应F片段的开头，故选B。
随着PCR技术的改进，新冠病毒的核酸片段是通过实时荧光PCR的检测的。那么，荧光定量PCR的原理究竟是什么？下面结合例题进行分析。
【例5】新型冠状病毒是一种单链RNA病毒，新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定，请回答以下问题。
（1）首先，从样本中提取病毒RNA，经____酶作用生成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
（2）通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqD⁃NA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（图6A）。
图6 实时荧光PCR
①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火，通过形成_________而特异性结合。
②在PCR循环的________阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈_______关系。
（3）在通过实时荧光PCR检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图6B所示。
①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有______________。
②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就__。
③某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct＞40或无Ct值判定为阴性。图6B所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为____________。
（4）阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有______________（列举2例）。
参考答案：（1）逆转录 （2）氢键 延伸 正比例 （3）底物浓度下降、酶活性下降 越小 阳性（4）①取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值 ②样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解 ③病毒发生变异
难点分析：传统PCR进行检测时，扩增后的产物需要进行染色和电泳分离，并且只能作定性分析，应用受到限制。实时荧光PCR是指在反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法（图6）。其基本原理是：在PCR扩增时，除加入引物外，同时加入特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。扩增前，探针结合在DNA单链上，因报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光信号；
扩增时，TaqDNA酶将探针降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物定量关系。
