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在创面愈合、组织移植的过程中，如何能构建新生血管，建立新的血液循环，起着至关重要的作用。因此，学者们进行了大量的研究，试图了解并寻求在血管化建立的过程中，发挥作用的各个环节及影响因素，通过控制这些因素提高组织的血管化进程及再生修复能力。近年来的研究显示间充质干细胞（Menchymal stem cells，MSCs）对血管化具有明显的促进作用。MSCs最早是由Friedenstein[1]在骨髓中发现的，此后研究发现MSCs可以广泛分布于体内其他组织中，包括脂肪、肌肉、肝脏、胰腺、肾脏和脐血等处，其中脂肪来源的MSCs（Adipose-derived stem cells,ADSCs，ADSCs)因其来源广泛、取材方便等优势逐渐受到重视，ADSCs对血管化的影响更是很多专家学者研究和致力的方向。本将就近年来ADSCs对血管化促进作用的研究状况进行综述。
1 脂肪干细胞的生物学特性
ADSCs是从脂肪组织中分离出来的具有多向分化潜能的成体干细胞。2001年，Zuk等[2]首次从人吸脂术抽取的脂肪组织悬液中分离提取到ADSCs，此后人们对ADSCs的研究就一直在不断深入。作为一种多能干细胞，ADSCs和骨髓间充质干细胞（Bone menchymal stem cells，BMSCs）在细胞生长增殖方式、多向分化潜能等方面都无显著差异[3]，在体外可以诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经细胞、肝细胞、胰岛细胞、表皮细胞、真皮细胞和牙齿相关细胞等。在表型上，其阳性表达CD9，CD29，CD49，CD54，CD105，CD106，CD166，CD44，CD71，CD10，CD13.CD73，CD90，CD146，CD55，CD59，Ⅰ和Ⅲ型胶原，骨桥蛋白，α平滑肌肌动蛋白，Ⅰ型组织相容性抗原HLA-ABC，阴性表达的分子有CD11b，CD18，CD50，CD56，CD62，CD14，CD31，CD45，Ⅱ型组织相容性抗原HLA-DR[4]。与BMSCs相比，ADSCs具有以下优势：①组织获取方法简单，来源充足，手术创伤小，可以反复取材；②脂肪组织中干细胞的含量非常丰富；③易在体外培养，且具有较强的体外增殖能力。随着分离技术方法的逐步改进，目前ADSC的分离、培养已经逐步成熟，在获得更多数量的同时，可以保证ADSC的活性功能及多向分化潜能。但由于尚未发现其特异性的表面标志，免疫组化和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞也只能起到辅助作用，目前鉴定脂肪干细胞的最好方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导的成功。
2 脂肪干细胞在组织修复中血管化的作用机制研究
创面愈合是经过炎症反应，上皮形成，血管形成及扩增等一系列步骤完成的，而形成成熟且有功能的血管网络则依赖于内皮细胞和平滑肌细胞的相互作用。目前已经证明，ADSCs在体内外均可以分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞，同时还可以分泌多种促进血管化的细胞因子，协同机体内其他促血管新生细胞共同完成受损组织的修复过程。
2.1 脂肪干细胞向血管内皮细胞、平滑肌细胞的分化：ADSCs在一定条件下可以向血管内皮细胞、血管平滑肌细胞分化。Cao等[5]将ADSCs培养在含有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic firbroblast growth factor，bFGF）的培养液中，发现有管样结构形成，内皮细胞表型表达呈阳性，并具有典型的内皮细胞吞噬功能。这一结果可以证明ADSCs在适当的条件下可被诱导成内皮细胞，并参与脉管管腔的形成。Matsumoto等[6]将标记有Dil的ADSCs与脂肪颗粒混合移植于裸鼠的背部皮下，4周后在移植物新生血管周围发现有标记Dil的血管内皮细胞生成。ADSCs这种向血管内皮细胞分化的能力被随后的大量实验不断证实[7-8]。此外，还有人在体外培养环境下，应用转化生长因子β1与血小板衍生生长因子-BB联合诱导14天后，发现ADSCs呈现血管平滑肌细胞特有的峰谷样生长，且表达血管平滑肌特异的表面抗原标记物，即α平滑肌激动蛋白、肌钙蛋白、肌球蛋白重链和平滑肌-22α，说明ADSCs具有向血管平滑肌细胞分化的潜能[9]。Lu等[10]通过向小鼠背部皮瓣基底注射ADSCs术后7天，分析背部皮瓣血管密度和单位组织内血管内皮细胞数量发现，实验组的血管密度和血管内皮细胞数量最大，认为ADSCs有促进血管重建功能。另有实验发现，ADSCs对缺血患肢的效果要优于BMSCs，与BMSCs 和内皮前体细胞移植仅形成毛细血管不同，脂肪干细胞在移植后还形成类似于结构完整的较大的血管样结构[11-12]。提示ADSCs在新血管形成方面具有更大的潜力和优势。
2.2 脂肪干细胞的旁分泌功能：ADSCs能够促进血运的恢复不仅是由于具有向血管内皮细胞、平滑肌细胞分化的潜能，旁分泌作用在其中也起到了重要作用。许多实验证实，ADSCs 能通过自分泌或旁分泌的途径来上调一些促血管生成细胞因子的表达，如VEGF、bFGF、血管生成素-1（angiopoietin-1,Ang-1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor -β,TGF-β）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth facor，PDGF) 、胎 盘 生 长 因 子(placenta growth factor ,PlGF )等。在缺血等病理条件下，bFGF和VEGF在mRNA水平和蛋白水平表达会进一步增多[13-15]。
Zografou等[16]将分离、培养后的ADSCs用荧光染色标记后注射到行全厚皮肤移植的小鼠皮下，实验结果显示，实验组移植物坏死的面积远小于对照组（6.12%vs 32.62%，P＜0.01）,实验组移植区血管密度明显增加，胶原增厚，VEGF和TGF的表达较对照组明显升高。王杰华等[17]将SD大鼠制备成局灶性脑缺血模型（MCAO模型），将用DAIP标记后的ADSCs注入大鼠侧脑室，经术后4天、7天、14天取脑组织，采用免疫组化和半定量RT-PCR法检测缺血区脑组织的新生血管及bFGF、VEGF表达的动态变化。结果发现ADSCs组较对照组缺血区的微血管密度、脑组织中bFGF及VEGF的表达水平均明显增高，且微血管生成的数量与bFGF、VEGF的表达趋势一致，表明ADSCs可以促进缺血损伤脑组织中新生血管形成以及bFGF和VEGF表达的上调。
2.3 脂肪干细胞与其他促血管新生细胞的协同作用：ADSCs不仅能通过诱导向促血管新生的细胞分化，还可以与其他促血管生长的细胞协同作用，增强各自促血管新生的能力。将ADSCs与血管内皮细胞共同培养后注入受区，可见ADSCs聚集在毛细血管周围，紧贴血管壁，同时血管伸出新芽，并且发现血管内皮细胞存活率大大提高，联结成血管网络的能力明显增强[18]。ADSCs还可以通过表达缝隙连接蛋白Connexin43来调节内皮细胞与血管壁细胞之间的相互作用，以维持新生血管的稳定性。在这一过程中ADSCs所分泌的细胞因子如VEGF、PDGF-β、TGF-β-、Ang-1及其受体TIE也发挥了重要的作用[19]。同样，血管内皮细胞也可以分泌多种细胞因子作用于ADSCs，如bFGF可以刺激ADSCs生长，PDGF通过c-Jun氨基端激酶蛋白激酶途径诱导ADSCs增殖和迁移[20-21]。血管内皮细胞还可以与ADSCs相互作用调节细胞因子的分泌，促进两种细胞分泌的细胞外基质积累，反过来诱导血管成熟[22]。ADSCs还可以与成纤维细胞协同（Fibroblast，FB）来促进创伤愈合。FB是创面修复中起重要作用的细胞，ADSCs可以促进FB在增殖的同时增强其迁徙能力，并且是通过其旁分泌VEGF、HGF、bFGF的功能来实现的[23]。Kim等[24]在研究中发现，ADSCs促创面愈合和抗氧化的作用可以通过刺激FB和角化细胞来发挥功能，被活化的两种细胞以旁分泌的方式对周围创伤组织的修复起到促进作用，从而加速创面的愈合。Kim等[25]还在实验中发现ADSCs通过刺激FB，促进了皮下胶原的合成，在促血管新生的同时增加了皮肤的厚度、皮下胶原密度及成纤维细胞数量，将ADSCs带入皮肤抗衰老的研究领域，拓宽了ADSCs在未来的应用范围。
3 ADSCs作为基因转染的靶细胞发挥促血管化作用
目前普遍认为VEGF主要作用于血管形成的早期，促进原始血管网的生成；Ang作用于随后的血管改建和塑形阶段，促进成熟、有空间结构的血管网形成；PDGF和TGF-β主要促进周细胞和平滑肌细胞的动员，促使新生毛细血管动脉化[26]。基于这种理论 ，Chen等[27]发现通过空间定位和时序性控制对VEGF、PDGF的释放，可以获得更成熟的血管。然而由于直接应用这些生长因子存在半衰期短、效应无法长时间发挥的弊端，所以近年来，生长因子的释放技术成为又一项研究热点。利用基因转染技术将目标因子的基因介导至种子细胞内，使细胞持续合成并表达所需的生长因子，从而发挥生物学作用。而ADSCs作为组织工程中一种非常理想的种子细胞，应用基因转染技术，将目的基因如VEGF、HGF等导入ADSCs，不仅可以对生长因子的释放时机、浓度梯度进行人为控制，还可以利用ADSCs自身的趋化性、“归巢”作用将目的基因携带至受损区域，充分发挥促血管新生及损伤修复的作用。因此，出现了大量利用细胞基因转染技术转染ADSCs来促进血管化的实验研究。Lei等[28]证实ADSCs可作为载体细胞运送VEGF基因到皮瓣远端并通过分泌VEGF提高皮瓣的成活面积。吴一杰等[29]应用腺病毒介导HGF基因转染ADSCs，作用到游离移植的脂肪组织中，促进了脂肪颗粒的血管化，增加了脂肪的成活率和质量。但是这种基因治疗方法的稳定性、可控性及安全性尚需进一步研究。
4 影响ADSCs发挥作用的其他因素
ADSCs对组织的血管化、新生血管的重塑是通过多种机制进行的。不仅依赖细胞因子及细胞基质间的相互作用，还受其他因素调控。
4.1 ADSCs的归巢作用：近年来随着干细胞微环境（stem cell niche）的提出，如何创造一个适合干细胞生存的微环境，是应用细胞技术促进创面再生与修复的重要条件。ADSCs通过分泌和释放一系列细胞因子，在一定程度上起到了改善微环境的作用，可能会更加利于干细胞生长、调节自我更新[30]。南华等[31]将Dil标记后的ADSCs通过SD大鼠尾静脉注射来观察ADSCs在动物体内的分布情况，在细胞移植后48天，获取实验组器官组织，用荧光显微镜观察，发现肺、脾组织内滞留大量且发出较强荧光的细胞，肝、心、肾组织内亦可见较多细弱荧光颗粒分布，远隔部位的正常皮肤组织及内脏脂肪中仅见少量荧光；对比正常皮肤软组织与创伤愈合组织，后者积聚的标记细胞数量明显多于前者，且标记细胞主要聚集于创伤区皮肤组织、皮下组织深层内，皮下组织浅层和肌层内仅少量荧光。乔晓俊等[32]将ADSCs经脊髓损伤的大鼠尾静脉移植后，观察ADSCs在受损伤脊髓组织的聚集情况，发现被标记的ADSCs能迁移到脊髓受损区，并随时间的推移，细胞迁移有增加的趋势。这些现象可以体现出ADSCs作为干细胞具有“归巢”作用[33]，即在体内具有向创伤部位定向迁移的能力，但其具体机制尚不明确，可能与创伤引起的局部微环境改变有关。但是这种“归巢”作用起效较慢，局部注射可能会发挥的更大效力。
4.2 缺氧环境对ADSCs的影响：ADSCs本身耐缺氧能力较强，在缺氧的环境中可以释放抗氧化物质、自由基清除剂、分子伴侣、热休克蛋白等，清除受损局部区域的细胞毒性物质，促进尚存活的物质复苏[34]。在1%的低氧环境中培养ADSCs，能够检测到与血管增殖相关细胞因子表达的上调[35]，ADSCs 在2%的低氧环境中，VEGF和bFGF的分泌量要高于其在正常氧含量的环境，且细胞促胶原合成、促成纤维细胞的迁移能力更强[36]。Rehman等[37]的实验显示，在低氧环境中，ADSCs分泌的VEGF约为正常氧含量中的5倍，且能明显促进血管内皮细胞的生长和减少内皮细胞凋亡。但是这种低氧环境对ADSCs分泌功能的影响机制尚不明确。然而可以预见，临床应用前使用低氧环境处理ADSCs，以延长其生存能力和激发干细胞特性可能是一个行之有效的方法。但在创伤部位，组织的正常结构及血供遭到破坏后产生的低氧环境对ADSCs的影响还需进一步研究。
现在针对ADSCs的研究大多数是在体外环境中进行的，如何能在接近体内内环境的状态下研究ADSCs的特性，特别是在病理状态下的微环境中ADSCs将如何发挥作用，也是今后研究的方向之一。对于ADSCs的储存条件有研究认为可利用深低温保存ADSCs，其增殖分化潜能及旁分泌因子的特性不会受到影响[38]，也有利于其将来向商品化方向推广。
4.3 ADSCs培养及其增殖的稳定性:对于ADSCs培养、增殖的稳定性问题，学者们各持己见。姚素艳等[39]为了检测ADSCs长期培养后的细胞活力，用MTT法检测了传代后第3、6、9代细胞的活力，结果显示培养的ADSCs生长状态良好，在细胞活力方面第2～8代细胞无明显差异，但第9代细胞活力开始下降。王先成等[40]通过培养发现ADSCs增殖速度稳定，细胞群体倍增时间约为29h，将细胞传代20代后，细胞形态没有明显的改变，染色体核型分析结果表明细胞仍为正常的二倍体核型，传至20代后，细胞可在体外扩增3.487×109倍。而有实验结果发现，ADSCs在无任何干预因素的条件下持续传至25代时多条染色体出现断裂、畸变，呈现亚二倍体核型或超二倍体核型，甚至个别染色无法辨认，从而认为ADSCs在体外传代的过程中并不能永久地维持稳定的二倍体结构，具有向肿瘤细胞发展的倾向[41]。ADSCs作为多能干细胞的一种，有着干细胞的共性，理论上具有无限增殖的能力，但从其临床应用的价值来看，这种细胞治疗的安全性应该是第一位的，所以对ADSCs在遗传稳定性方面的研究需进一步明确，这也是其将来应用到临床治疗的前提条件。
综上所述，ADSCs促进组织修复中血管生成的作用是可靠的，相信随着对干细胞移植基础研究的不断深入，以及通过动物实验和临床实验的不断探索，ADSCs的实验方法也会更加规范。虽然目前血管化的速度还无法完全满足移植物对血供的要求，但这一问题可以通过预血管化方式进行弥补，对组织损伤的修复具有重要意义。
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[收稿日期]2012-02-06 [修回日期]2012-03-16
编辑/李阳利
