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【摘要】 目的 研究不同剂量雌激素对皮瓣存活面积的影响，并探讨其作用机制。方法 新西兰白兔30只，随机分为A、B、O三组。在兔背作超长型皮瓣，其蒂部注射雌激素，三组间剂量不同。术后检测皮瓣血管内皮生长因子（VEGF)、一氧化氮（NO）、皮瓣存活面积（S）等指标。结果 A组、B组皮瓣的NO、VEGF、S较O组增加；皮瓣存活面积S与VEGF表达、NO含量之间呈正相关。结论 雌激素处理可使皮瓣VEGF表达上调、NO含量增加。�
【关键词】雌激素；皮瓣存活面积； 血管内皮生长因子；一氧化氮
Experimental study of estrogen in increasing the flap survival area
XU Rui-sheng,GAO Jin-shuang.Orthopedies department of Dongying People’s Hospital Shandong 257091,China
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【Abstract】 Objective To study the effects of estrogen on flap survival,andinvestigate the invovled mechanism and regularity.Methods Thirty rabbits were divided radomly into three groups,which named Group A,Group B and group O.Group O was the control group.A random pattern flap was harvested on every rabbit’s back.Group A,Group B received subdermal estrogen injection of various doses.Postoperation,detected VEGF,NO and the survival area of every flap.Results The flap survival area,NO content，expression of VEGF in Group A and Group B increased compared with group O；The survival area of skin flap was highly related to VEGF、NO through linear regression analysis.Conclusion Estrogen injection can increase the VEGF of expression and NO content of flaps.�
【Key words】Estrogen；Flap survival；Vascular endothelial growth factor；Nitric oxide
皮瓣移植后如何提高存活面积是关键性问题。目前在临床上仍然缺乏可靠实用的提高皮瓣存活的方法。雌激素在损伤保护及血管扩张方面的作用非常明确，因而，笔者设计本实验，以观察雌激素对皮瓣存活面积的影响，并探讨其作用机制。
1 资料和方法
1．1 主要实验试剂及仪器 一氧化氮试剂盒，(Cayman,USA)；兔抗兔VEGF多克隆抗体，(Sigma,USA)；752型分光光度计，Ld50-2a离心机由泸州医学院附属医院中心实验室提供使用。苯甲酸雌二醇注射液，(Cayman,USA)。
1．2 动物分组、模型建立和处理方法 新西兰白兔30只，3~4月龄，体重1．5~2．2 kg，雌雄不限(购自泸州医学院实验动物科)。参照随机数字表，把白兔分成A，B，O三组，每组10只,O组为对照组。各动物均行手术建立动物模型：3%戊巴比妥钠耳缘静脉注入麻醉，以兔背中线为轴，蒂在头侧的随意皮瓣，大小（3×12）cm2。皮瓣两侧相对缝合，尾端原位缝合，制成皮管，供区创缘直接缝合。术后第2、4、6 d于皮瓣近段皮下注苯甲酸雌二醇注射液。A组注射剂量为100 μg/kg体质量,B组注射剂量为50 μg/kg体质量；O组不注射，为对照组。术后第4、7 d在皮瓣近侧取少块皮瓣全厚组织，检测组织块VEGF表达。术后第5 d于皮瓣近段采血，检测血清NO含量。术后第7 d断蒂，测量皮瓣存活面积。
1．3 观察指标
1．3．1 大体观察 观察动物的生活行为及皮瓣颜色、硬度、皮温和有无肿胀、渗出等。
1．3．2 皮瓣存活面积 皮瓣术后7 d断蒂，用硫酸纸精确描绘，测量皮瓣存活面积。坏死标准：皮瓣变黑变硬，针刺无出血。
1．3．3 血清一氧化氮(NO)含量 将所采血样加入促凝管静置2 h，3000转/分离心15 min，取上清得血清。测定NO采用硝酸还原酶法。严格按照说明书的规范操作法进行操作，测定各管的吸光度。
1．3．4 皮瓣VEGF表达 所取组织块用免疫组化S-P法检测血管内皮生长因子(VEGF)。免疫组化染色结果判断：细胞内出现棕黄色颗粒判定为阳性。按VEGF染色强弱及阳性细胞数两个方面计算评分：a.染色强度(0=无，1=弱，2=中，3=强)；b.阳性细胞数：含棕黄色颗粒的内皮细胞占总血管内皮细胞的比例(0=无阳性细胞，1=阳性细胞数50%)。记录（a+b）得分分值，作为计量指标(同一动物术后第4、7天两次切片得分相加求平均值)。
1．4 统计学方法 采用SPSS10．0统计软件包对数据进行分析。不同组间的指标比较，采用单因素方差分析，并检验方差齐性。对皮瓣存活面积S与VEGF，NO等之间的关系做直线相关分析。
2 结果
2．1 大体观察 术中B组、A组和O组各1只兔因麻醉原因死亡。因各组均存活9只，满足统计学要求，未予补足10只。其后各组动物健康，皮瓣全部成活，无感染。术后3 d起各皮瓣远段出现不同面积的坏死。
2．2 皮瓣存活面积 ①A组、B组、O组三者之间皮瓣存活面积S(cm2)之间，方差齐性检验P=0．039,表明方差不齐，采用Dunnett T3法分析三组间差异，F=6．493，P=0．006，表明三组间有显著性差异；②以性别作为分组因素，对雌、雄性之间存活面积进行统计分析，方差齐性，F=0．146，P=0．705，表明性别之间皮瓣存活面积不存在显著性差异。
2．3 皮瓣血清NO结果 A组、B组、O组 NO(μmol/L)三者之间统计学分析，方差齐性，F=4．008，P=0．031，表明三组NO均数间有显著性差异。
2．4 皮瓣VEGF表达结果 A组、B组、O组三者VEGF（如图1、2、3）分值之间，方差齐性，F=8．96，P=0．01，表明三组VEGF表达分值的均数之间有显著性差异。
2．5 皮瓣存活面积与VEGF、NO 之间相关分析的结果（表1） 皮瓣存活面积S与VEGF表达之间相关系数r=0．697，P=0．002,表明二者之间相关关系成立，相关比较密切。皮瓣存活面积S与NO含量之间相关系数r=0．755，P=0．001，表明二者之间相关关系成立，相关密切。
3 讨论�
皮瓣血供不足及缺血再灌注损伤被认为是造成皮瓣坏死的主要原因。皮瓣移植后如何改善皮瓣血供，减轻皮瓣缺血再灌注损伤，是深受重视的课题。�
笔者采用雌激素于皮瓣蒂部注射，设定不同的剂量组别,并对多项指标进行检测。结果显示：皮瓣存活面积提高，VEGF、NO两项指标升高，皮瓣存活面积与两个指标间存在相关关系。其机制涉及许多方面：
3．1 NO作用复杂，是一种重要的血管舒张因子，可扩张局部血管,调节皮肤微循环，影响皮瓣的血液供应[1]；NO可抑制中性粒细胞粘附于血管内皮细胞，能减少中性粒细胞渗出，减轻缺血再灌注损伤。�
近年来，许多研究者[2] [3]应用NO的前体L-精氨酸、NO合酶抑制剂等对皮瓣进行处理，结果表明，NO的升高能改善皮瓣微循环，提高皮瓣的存活面积。
3．2 VEGF可特异性地刺激血管内皮细胞增殖，促进血管生成，抑制多种因素导致的内皮细胞凋亡；并可通过促进血管内皮细胞一氧化氮和前列环素的合成使血管通透性增高。�
近年来，使用VEGF治疗缺血皮瓣的研究表明：VEGF可诱导新血管形成和提高缺血皮瓣的存活面积。Lubiatowski等[4]研究表明VEGF基因治疗可以增加肌皮瓣的血流灌注：鲁晓波、郝建伟等[5]研究发现：皮瓣移植后VEGF表达与微血管密度呈密切正相关，VEGF的表达可间接反映血供重建情况。
3．3 VEGF与NO的相互促进作用 VEGF可刺激内皮细胞产生NO，并使其浓度呈剂量依赖性升高；而NO 在VEGF促使内皮细胞分裂中也起关键作用[6]，NO可上调VEGF诱导内皮细胞增殖过程中的细胞外信号激酶的活性而促进VEGF使血管内皮增殖的作用。
3．4 雌激素 可刺激血管内皮细胞NO的产生，抑制内皮素的释放，发挥扩张血管的作用。雌激素可以使VEGF的表达上调[7]。Chen Z等[8]动物实验证明，应用雌激素可提高NOS活性，诱导产生内源性NO。�
这与我们的实验结果所示雌激素处理可使皮瓣VEGF、NO升高，使皮瓣存活面积增加相符。�
综上所述，雌激素可通过促使内皮细胞释放NO和促进VEGF表达等途径，促进皮瓣新生血管生成，扩张皮瓣血管，增加血流量，促进皮瓣存活。我们的研究结果为改善皮瓣存活提供了新思路，虽然雌激素应用在其剂量、方法、剂型上尚有待进一步研究，但它能从多方面促进皮瓣成活，继续深入研究并探讨其机理有很高的实用价值。�
参考文献
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