泰山螭霖鱼线粒体COⅠ基因序列的遗传多样性分析

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摘要[目的]通过克隆泰山螭霖鱼的COⅠ基因序列，研究其与鲤科几属鱼类的进化关系，确定泰山螭霖鱼的分类地位。[方法]以泰山螭霖鱼30个个体为材料，对其线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）的部分序列进行PCR扩增和序列对比，检测泰山螭霖鱼的遗传多样性；计算泰山螭霖鱼不同单倍型与GenBank中鲤科5个属鱼类的遗传距离，采用聚类分析方法，构建NJ和UPGMA系统进化树。[结果]30个个体泰山螭霖鱼线粒体COⅠ基因片段长度约1 600 bp，无碱基的插入和缺失，纯化并去除引物序列后获得约1 493 bp的核苷酸序列，存在6种单倍型，共检测到6个多态位点，包括4个转化、2个颠换，其单倍型多样性（Hd）为0.460，核苷酸多样性（Pi）为0.000 78，平均核苷酸差异数（K）1.163。遗传距离和NJ和UPGMA系统进化树表明，泰山螭霖鱼与多鳞白甲鱼的COⅠ序列一致，泰山螭霖鱼所在的突吻鱼属与光唇鱼属的亲缘关系最近，与金线鲃属、倒刺鲃属、华鲮属的亲缘关系较远。[结论]该研究为其种质资源的管理与保护及遗传育种提供分子生物学依据。

关键词泰山螭霖鱼；COⅠ；遗传多样性

中图分类号S917；Q958.1文献标识码A文章编号0517-6611（2016）27-0127-04

Abstract[Objective] Through cloning COⅠ gene sequence of Varicorhinus macrolepis， its evolutionary relationship with other genus fish in Cyprinidae was studied， the classification status of V. macrolepis was determined. [Method] 30 V. macrolepis were used as experimental materials， mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ（COⅠ） gene fragment was amplified using PCR technique and aligned of sequence， genetic diversity of V. macrolepis was detected，and genetic distance between different haplotypes of V. macrolepi and 5 genus of Cyprinidae in GenBank was calculated. Clustering analysis was used to build NJ and UPGMA phylogenetic tree. [Result] The results showed that the COⅠgene fragment PCR products of 30 V. macrolepis were about 1 600 bp， and no insertion/deletionwas observed， 1 493 bp nucleotide sequences were determined after being purified and excluded the primer sequence. There were 6 haplotypes， and 6 polymorphic sites were detected， including 4 transition sites and 2 transversion sites. Haplotype diversity （Hd） of V. macrolepis was 0.460， nucleotide diversity （Pi） was 0.000 78， average number of nucleotide differences （K） was 1.163. Genetic distance and NJ UPGMA phylogenetic trees showed that the sequences of V. macrolepis and O. macrolepis are the same. The genetic relationship between Varicorhinus and Acrossocheilus was the closest， while the genetic relationship between Varicorhinus and Spinibarbus， Sinilabeo，Sinocyclocheilus were far. [Conclusion] The study can provide molecular biology basis for management， protection and genetic breeding of germplasm resources.

Key wordsVaricorhinus macrolepis； COⅠ Gene； Genetic diversity

泰山螭霖鱼（Varicorhinus sp.）属鲤科鲃亚科突吻鱼属，是生活在泰山海拔270～800 m山涧溪流中的一种小型野生鱼类，其肉嫩味美、营养丰富，具有独特的药用保健价值[1]，是泰山特有的珍贵生物，也是我国“五大贡鱼”之一[2]。对于泰山螭霖鱼的研究，自20世纪90年代起，鱼类学者们对其生态习性和生物学特点、人工驯化和繁殖、解剖学、生长性能、染色体核型、同工酶[2-7] 进行了研究，近年来，利用分子标记技术对泰山螭霖鱼的遗传多样性和部分功能基因进行了研究[8-12]，在线粒体DNA的研究方面，陈红菊[11]对其线粒体Cytb和D-loop进行研究，有关泰山螭霖鱼线粒体COⅠ基因的研究鲜见报道。笔者通过克隆泰山螭霖鱼的COⅠ基因序列，研究其与GenBank中同源性较高的鲤科几属鱼类的进化关系，确定泰山螭霖鱼的分类地位，以期为其种质资源的管理与保护及遗传育种提供分子生物学依据。

1材料与方法

1.1材料

泰山螭霖鱼取自泰安市泰山螭霖鱼原种场，样本数量为30个；PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；DNA提取试剂盒（SK）购自上海生工生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Marker等为大连宝生物工程有限公司生产；PCR仪为TaKaRa TP650型。

1.2方法

1.2.1

基因组DNA的提取。

取泰山螭霖鱼背部肌肌肉约20 mg，用DNA提取试剂盒（上海生工）提取样品的基因组DNA，经 OD260/OD280和琼脂糖凝胶电泳来检测所提取DNA的浓度和纯度。

1.2.2引物设计及PCR扩增。

根据GenBank（NC_NC_023799.1）中的相应序列设计引物，用于COⅠ基因序列的扩增，引物序列为CO-S：ACTCGGCTACCTTACCTGTGGC，CO- A： CTCGTTAGTTTGATTGAACT。

PCR扩增体系50 μL，

其中， 10×Buffer（TaKaRa）5 μL，MgCl2（25 mmol/L）4 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，Taq酶（TaKaRa，5 U/μL）0.5μL，上、下游引物（10 μmol/L ）各2 μL，模板DNA 2 μL，补足灭菌双蒸水至50 μL。

扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物技术有限公司，纯化后采用上述引物进行双向测序。

1.2.3序列分析。

测序结果经DNASTAR软件拼接并辅以人工校对，利用MEGA 6.06软件，与从GenBank中查到的多鳞铲颌鱼相应序列（NC_NC_023799.1）用Clustal W进行比对分析，统计序列的碱基组成和转换/颠换比率（Ts/Tv ratios）、变异位点，采用Kimura 2-parameter模型计算个体间的遗传距离，邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建单倍型分子系统树，自举检测（bootstrap）1 000次计算各分支置信度；采用DNASP v5.10软件计算单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）和平均核苷酸差异数（K）。

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

采用引物CO-S和CO-A对30尾泰山螭霖鱼的基因组DNA进行PCR扩增，结果均扩增出一条约1 600 bp的条带（图1）。

2.2COⅠ基因片段的序列分析

2.2.1序列分析。

泰山螭霖鱼30个样本线粒体COⅠ基因的

测序结果经DNASTAR软件拼接并辅以人工校对，去除部分端序列后，获得1 493 bp的片段。采用MEGA 6.06软件经BLAST分析，该片段与GenBank中多鳞白甲鱼（KF999680.1）的COⅠ基因片段同源性高达100%，确定该产物为泰山螭霖鱼COⅠ基因的部分序列。

用MGEA 6.06 软件对测得序列进行比对分析，在测定的1 493 bp片段中，无碱基的插入与缺失，其中，保守位点1 487个，变异位点6个，占整个序列的0.4%，简约信息位点4个，占整个序列的0.27%。变异位点包括4个转换（transition）、2个颠换（transversion），转换颠换比（Ts/Tv）为2∶1，碱基替换均发生在第3位密码子上，所编码的氨基酸无变化。

用DNASP v5.10 软件分析30个样本COⅠ序列，共检测

到6种单倍型（表1），绝大多数个体为单倍型Hap-1，其余5种单倍型出现的频率较低，分别为 1～3个样本。

2.2.2

碱基组成和遗传距离。

采用MGEA 6.06软件统计泰山螭霖鱼COⅠ基因片段的碱基含量，其平均为T 28.5%、C 269%、A 26.8%、G 17.8%。G+C含量（44.7%）略低于A+T含量（55.3%），其中，碱基G在1、2、3位的含量变化很大，分别为30.3%、14.9%和8.3%。基于Kimura-2-parameter计算遗传距离，自举检测（bootstrap）1 000次计算各分支置信度，30个样品的相对遗传距离为0～0.403。

泰山螭霖鱼COⅠ基因6种单倍型与GenBank中的鲤科部分鱼类的遗传距离见表2。由表2可知，泰山螭霖鱼6个单倍型间的遗传距离在0.07～0.41，泰山螭霖鱼单倍型（Hap-1）与多鳞白甲鱼（O.macrolepis）的遗传距离为0，与铲颌鱼属的遗传距离也较近，为10.37，其次是光唇鱼属，再次是倒刺鲃属，与华鲮属和金线鲃属的遗传距离最远。

2.2.3遗传多样性分析。

利用DNASP v5.10软件分析30个泰山螭霖鱼样品COⅠ基因的遗传多样性，结果表明，其单倍型数为6，单倍型多样性（Hd）为0.460，核苷酸多样性（Pi）为0.000 78，平均核苷酸差异数（K）为1.163，遗传多样性处于较低水平。

2.2.4聚类分析及系统发育分析。

利用MGEA 6.06构建了泰山螭霖鱼30个样品的UPGMA系统树（图2）。由图2可知，30个样品可聚为2个主要分支。

将泰山螭霖鱼COⅠ基因6个单倍型序列与GenBank中同源性较高的鲤科突吻鱼属（白甲鱼属）（Varicorhinus 、Onychostoma）、光唇鱼属（Acrossocheilus）、倒刺鲃属（Spinibarbus）、华鲮属（Sinilabeo）、金线鲃属（Sinocyclocheilus）的几种鱼类同源序列进行聚类分析，采用双参数模型（Kimura 2-parameter）作为距离参数，分别以邻接法（neighber-joining，NJ）和UPGMA法构建分子系统树，自举检测（bootstrap）1 000次计算各分支置信度（图3、4）。由图3、4可知，5个属的鱼类可分为2个大的分支，突吻鱼属与光唇鱼属聚为一大类，倒刺鲃属、金线鲃属、华鲮属鱼类聚为一大类。泰山螭霖鱼的6个单倍型先与多鳞白甲鱼聚在一起，再与粗须白甲鱼、小口白甲鱼聚在一起，然后与台湾铲颌鱼聚在一起；与稀有白甲鱼、高体白甲鱼及光唇鱼属几种鱼类的亲缘关系次之，与倒刺鲃属、金线鲃属、华鲮属的亲缘关系较远。

3讨论

（1）线粒体DNA具有进化速度快、变异性大、母系遗传及易于扩增等优点，是研究种内和种间进化关系和遗传多样性的有效分子标记，而线粒体 COⅠ基因进化速度较快，适合种群水平差异的检测，也可用于种间分析。彭士明等[13]、马凌波等[14]、姜虎成等[15] 、朱立静等[16]通过分析银鲳、青蟹、日本沼虾、四角蛤喇等物种群体的线粒体COⅠ基因序列差异，研究其遗传结构和系统演化。该研究通过分析泰山螭霖鱼COⅠ基因序列的差异及其与鲤科几属鱼类同源序列的进化关系，探讨其遗传结构、遗传分化和系统演化关系。

（2）种群的遗传多样性水平是反映物种遗传背景的资料，该研究表明，泰山螭霖鱼30个样本扩增的 COⅠ基因1 493 bp片段中，有6个突变位点，存在6种单倍型，核苷酸多样性（Pi）为0.000 78，平均核苷酸差异数（K）为1.163，其单倍型多样性（Hd）为0.460，表明泰山螭霖鱼群体具有较低的遗传多样性水平。这与公维华等[8]及郭金峰[9]的研究结果相似，他们分别利用微卫星标记研究了泰山螭霖鱼的遗传多样性，结果表明，泰山螭霖鱼野生群体和养殖群体遗传结构无差异，是一个非常纯合的群体。这是由泰山螭霖鱼生存环境和生活习性所决定的，它生存于泰山，分布在海拔270～800 m的山涧中，不与外界水域交流，加之群体数量小，经长期的近交繁殖和瓶颈效应，多数基因已纯合，另外，环境的选择压力对其影响不大，形成基因突变和重组的概率很小，故出现遗传多样性降低的现象。

（3）关于突吻鱼属的分类地位，有学者认为突吻鱼属是白甲鱼属的同物异名，伍献文等[17]研究了我国的标本后，认为白甲鱼亚属（Onychostoma）和铲颌鱼亚属（Scaphesthes）是突吻鱼属（Varicorhinus）的2个亚属。

关于泰山螭霖鱼的分类地位，有学者认为是多鳞铲颌鱼，该研究通过对泰山螭霖鱼与同亚科其他属鱼类基于COⅠ基因的聚类和系统发育分析，结果表明，泰山螭霖鱼6个单倍型中，绝大多数个体COⅠ序列单倍型为Hap1，与突吻鱼属（白甲鱼属）的多鳞白甲鱼（O.macrolepis）的COⅠ序列完全一致，在突吻鱼属内，泰山螭霖鱼先与多鳞白甲鱼聚在一起，然后与粗须白甲鱼、小口白甲鱼聚在一起，再与台湾铲颌鱼聚为一类。泰山螭霖鱼所在的突吻鱼属与鲤科几属鱼类的亲缘关系：与光唇鱼属的关系最近，与金线鲃属、倒刺鲃属、华鲮属的亲缘关系较远。

该研究结果与陈红菊[11]的研究结果有所不同，陈红菊[11]通过对泰山螭霖鱼线粒体Cyt b 序列分析，发现泰山螭霖鱼和多鳞铲颌鱼聚在一起，确定泰山螭霖鱼为多鳞铲颌鱼。泰山螭霖鱼与光唇鱼属的关系最近，其次是倒刺鲃属，与四须鲃属和金线鲃属的关系较远。

参考文献

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