一种用于“自顶向下”,质谱数据分析的软件及其在蛋白质光解离质谱中的应用

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摘要：随着完整蛋白质离子碎裂技术的发展及其在自顶向下（Top-down，TD）蛋白质组学中的运用，蛋白质裂解的碎片质谱可提供更加丰富的碎片信息，因此，开发新的算法用于碎片离子的自动分析，已经成为自顶向下蛋白质组学中非常重要的任务。本研究开发了一个应用于分析自顶向下质谱数据的软件（NanKaiTop-Down，NKTD），其主要特点是采用“由一到多”式的寻找同位素峰簇的方法，实现了对重叠谱峰的自动解析。算法对已识别离子进行数据后处理和分析的结果有利于研究蛋白质离子在不同碎裂技术下产生的碎片离子信息。利用此软件对泛素蛋白离子在红外多光子解离（IRMPD）和紫外光解离（UVPD）两种裂解方法下的数据进行分析，结果表明，泛素蛋白离子在UVPD方法下产生的碎片离子种类非常丰富，其裂解位点覆盖率也远优于IRMPD方法。更为重要的是，在自顶向下质谱学中，这两种裂解方式具有良好的互补性。

关键词：自顶向下;蛋白质;谱峰识别;红外多光子解离;紫外光解离

1引言

电喷雾电离（Electro-sprayionization，ESI）[1]和基质辅助激光解吸附电离（Matrix-assistedlaserdesorptionandionization，MALDI）[2]技术的发明使得生物质谱进入一个全新的时代，也使蛋白质组学研究得到了快速发展。在蛋白组学研究中，使用最为广泛的是“自底向上（Bottom-up，BU）”的策略[3，4]，即将蛋白质复杂样品的酶切产物通过色谱进行分离后，再利用质谱并结合数据库搜索，实现肽段和蛋白质的鉴定。与BU策略互补的一项技术是“自顶向下（Top-down，TD）”策略，以及在此基础上发展起来的“自中向下（Middle-down，MD）”方法[5，6]。其中，自顶向下方法是直接将完整的蛋白质进行分离和离子化，然后在气相中利用串联质谱技术将其裂解，并通过数据库比对，实现蛋白质的鉴定以及翻译后修饰位点的鉴定。随着高分辨质谱技术及串联质谱技术的快速发展，以及TD方法的准确性和独特性，这种策略在近年逐渐成为蛋白质组学方法学研究的热点[7～16]。

自顶向下质谱技术现已在蛋白质鉴定中占有非常重要的地位。在此类工作中，通过算法自动解析质谱数据，进而实现蛋白质分子的鉴定，已经成为蛋白质组学研究中的热点。因此，许多研究人员和商业公司开发了许多优秀的算法和程序，如：ProSight[17，18]、MS-TopDown[19]、TopPIC[20]、MASHsuite[21]、MSpathFinder[22]、Ptop[23]、CUDA-TP[24]、SQID[25]、Sequest[26]、Mascot[27]、OMMSA[28]、ProVerB[29]、RT-PSM[30]等。这些算法多基于实验质谱与现有的数据库中的理论谱进行匹配，通过打分函数进行评判，将分值最高的、匹配度最好的理论谱对应的候选片段认定为该实验图谱对应的最佳结果。这些算法的实现，对蛋白质鉴定和分析起到了极大的促进作用，大大节省了相关科研工作者的时间和精力。

另一方面，在自顶向下的蛋白质组学中，为了更有效地实现蛋白质分子的裂解，研究者开发了多种蛋白质分子串联质谱的方法，如低能碰撞诱导解离（Collisioninduceddissociation，CID）[31]、电子捕获裂解（Electroncapturedissociation，ECD）[32，33]、电子转运裂解（Electrontransferdissociation，ETD）[34]、高能碰撞裂解（High-energydissociation，HCD）[35]、红外多光子解离（Infraredmultiphotondissociation，IRMPD）[36]、紫外光解离（Ultravioletphotodissociation，UVPD）等。这些质谱技术在“自顶向下”的蛋白质组学中的应用，使得蛋白质离子裂解后产生大量的、种类丰富的碎片离子。为了能够理解这些碎片离子种类、碎裂时的序列覆盖率以及其它信息（如气相中蛋白质离子的构象及构象变化），许多课题组研发了相应的算法和软件，以实现对这些碎片离子的鉴定和数据分析，如THRASH算法[37]、Decon2LS[38]、DeconMSn[39]、MS-Deconv[40]。其中，Horn等[37]開发的THRASH算法现已被广泛运用在很多软件中，成为目前主流的自顶向下质谱数据处理算法之一。该算法采用减法式谱峰发现的方法寻找可能的同位素峰。Jeon等[41]也对这一算法进行改进，使得其运行速度得到了提升。尽管如此，由于碎片离子的多样性以及普遍存在的谱峰重叠的情况，此类算法在重叠峰的处理中仍不够理想。在处理重叠峰的众多算法中，“同位素轮廓指纹比对”算法利用比例配分的方法能够较准确地解析出重叠峰，但其速度较慢;田志新课题组发明了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法，该方法以参与重叠的离子的理论同位素轮廓中无重叠的最高峰作为参考峰，对相应的实验同位素轮廓中每个同位素峰的实验强度进行归一化，因此该方法的计算量小、通量高、准确度高[42～46]，但在处理离子同位素全部重叠的情况下，该算法的处理效果就会稍弱一些。另外，已有的程序中，对复杂碎片离子的数据分析仍不够充分，影响了对实验结果的充分解读。基于此，本研究开发了NanKaiTop-Down（NKTD）应用程序，有效地解析了质谱图中的重叠峰，并进一步实现数据的分析和挖掘。

2实验部分

2.1仪器与试剂

配有电喷雾离子源的7.0TIonSpec型傅里叶变换离子回旋共振（Fouriertransformioncyclotroesonance，FT-ICR）质谱仪（美国Varian公司）;光学参量振荡（Opticalparametricoscillator，OPO）Firefly-IR型红外激光器（英国MSquared公司）;波长为193nm的ExcimerLasersSeriesCL5300型准分子激光器（俄罗斯Optosystems公司）;SSH-R型机械快门（日本Sigma-Koki公司）。

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