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骞秀芳，孙会仙，王 晨，陈 莹
目前，心脑血管疾病已成为我国居民死亡的主要原因之一，尤其是缺血性心脏病，呈逐年上升趋势。早期快速开通阻塞的冠状血管，给予再灌注治疗是改善心肌缺血的关键环节；
伴随再通的冠脉血流，心肌会再次受损，称之心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。银杏黄酮(ginkgetin, GK)为药用植物银杏(Ginkgo biloba L.)叶片的活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、降血脂、神经保护等多种药理效应，同时具备较好的安全性。近年来国内外学者实验研究发现，GK有助于改善MIRI受损的心肌组织，但其具体环节仍不明确。本研究从心肌细胞凋亡角度入手，通过构建MIRI大鼠模型，探讨GK对MIRI的保护作用。
1.1 动物 选取SD大鼠48只，雌雄各半，体重(200±20)g，由北京科宇实验动物养殖中心提供[许可证号：SCXK(京)2018-0010]。饲于动物房屏蔽环境，温度20～23 ℃，相对湿度60%～70%，明暗光照分别为12 h。所有动物相关操作规程均经武警北京总队医院动物伦理委员会批准认可。
1.2 药品与试剂 GK(黄酮含量≥24%)购自徐州峻源银杏制品有限公司，实验前以1%二甲基亚砜(DMSO)配成浓度2%、1%的溶液。氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、碘化丙啶(PI)，采用美国Amresco公司产品。半胱氨酸蛋白酶蛋白(caspase)-3、caspase-8活性检测试剂盒(荧光法)，美国Clontech公司产品。Trizol试剂、反转录试剂盒及实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒，美国Applied Biosystems公司产品。凋亡因子Fas、Fas-L及内参β-actin等引物均由上海生工生物工程股份公司设计并合成。
1.3 仪器设备 ECG-2360型十二导联心电图机，上海光电医用电子仪器有限公司产品；
DHX-500型动物人工呼吸机，北京金洋万达科技有限公司产品；
PT2500E型高速匀浆仪，瑞士Kinematica公司产品；
CKX41型光学显微镜，日本Olympus公司产品；
医学图像分析系统，北京环中睿驰科技公司产品；
FACS101型流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品；
SpectraMax iD3型荧光酶标仪，美国Molecular Devices公司产品；
Mx3000P型实时荧光定量PCR仪，美国Agilent 公司产品。
1.4 分组与预处理 将大鼠随机分为假手术组(等体积1% DMSO)、模型组(等体积1% DMSO)、GK高剂量组(200 mg/kg)、GK低剂量组(100 mg/kg)，每组12只。造模术前7 d开始腹腔给药，1次/d，造模术前30 min再给药1次。
1.5 MIRI模型的建立 采用冠脉左前降支结扎术造模。大鼠麻醉后仰位固定于手术台上，连接动物呼吸机并监测心电图；
于胸骨左旁第3、4肋间开胸，剪开心包膜，暴露心脏，左心耳下缘2 mm处进针，肺动脉圆锥旁出针，进针深度1 mm，将6-0缝线与充气球囊一同结扎左冠脉前降支，关胸；
球囊充气后，心电图ST段呈明显弓背抬高作为缺血成功的标志，持续45 min；
抽空球囊，再灌注6 h，心电图抬高的ST段下降50%以上作为再灌注成功的标志。假手术大鼠开胸后只冠脉穿线但不结扎，其余操作同上。
1.6 NBT染色法测定心肌梗死面积 再灌注结束后，每组随机取6只大鼠，处死后剪取心脏，洗净，去除心房及右室，置于-20 ℃冷冻30 min，沿长轴切成厚度2 mm的5片，浸于0.1% NBT溶液中，37 ℃下孵育30 min， 10%甲醛溶液固定24 h，正常心肌呈蓝色，缺血未梗死心肌呈浅红色，梗死心肌呈灰白色。显微镜下成像，导入图像分析系统，测算梗死区面积(infarct area, IA)、危险区面积(area at risk, AAR)和心室总面积(left ventricle area, LVA)，计算IA/AAR、IA/LVA以评估心肌梗死情况。
1.7 流式细胞术测定细胞凋亡率 每组取剩余6只大鼠，处死后剪取心脏，洗净，于冠脉结扎线下方取部分心肌组织，剪碎后加PBS缓冲液充分研磨，收集细胞悬液，1000 r/min低温离心5 min，弃上清，用PBS缓冲液洗涤数次并重悬，获得较纯的心肌细胞，于光镜下进行细胞计数，调整心肌细胞浓度约为1×10个/ml；
将心肌细胞重悬于70%预冷的乙醇中低温固定过夜，检测前1000 r/min低温离心，用PBS缓冲液洗去乙醇，细胞沉淀用PI低温避光染色30 min，上流式细胞仪检测。
1.8 荧光法测定心肌细胞caspase活性 取上述浓度1×10个/ml的心肌细胞，重悬于预冷的裂解缓冲液中，冰浴5 min，10 000 r/min低温离心5 min，收集上清(胞浆抽提物)，植于96孔板，按试剂盒说明书加入反应试剂和荧光底物，阴性对照孔中加入caspase抑制剂，37 ℃下避光孵育1 h，上荧光酶标仪(激发光波长400 nm，发射光波长505 nm)检测，以荧光强度(fluorescence units, FU)表示caspase-3、caspase-8活性。
1.9 RT-qPCR法测定心肌组织Fas、Fas-L基因表达 每组于冠脉结扎线下方取部分心肌组织，冻存于-80 ℃液氮中；
检测前精密称重，研磨成粉，经Trizol试剂法提取总RNA，后反转录为cDNA，继而行RT-qPCR扩增(引物片段长度149～163 bp)，获取样本基因Ct值后，以β-actin为内参照进行均一化处理，采用公式2计算样本基因的相对表达量。
2.1 对心肌梗死面积的影响 假手术组大鼠的梗死区面积为0。与模型组比较，GK高、低剂量组可使IA/AAR和IA/LVA显著缩小，差异均有统计学意义(<0.05，表1)。
2.2 对心肌细胞凋亡率的影响 假手术组心肌细胞凋亡率为(0.92±0.80)%，模型组细胞凋亡率显著增高为(43.13±7.05)%。与模型组比较，GK高、低剂量组可使细胞凋亡率明显降低为(30.12±7.28)%、(31.06±6.39)%，差异均有统计学意义(<0.01，图1)。
2.3 对心肌细胞caspase活性的影响 与假手术组比较，模型组心肌细胞caspase-3和caspase-8活性均显著增高，差异有统计学意义(<0.01)。GK高、低剂量组可使caspase-3和caspase-8活性明显降低，与模型组比较差异均有统计学意义(<0.05，表2)。
2.4 对心肌细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响 与假手术组比较，模型组心肌Fas和Fas-L基因表达均显著增高，组间差异均有统计学意义(< 0.01)。GK高、低剂量组可使Fas和Fas-L基因表达明显降低，与模型组比较差异均有统计学意义(< 0.05，表3)。
缺血预适应和缺血后适应是MIRI公认有效的治疗手段，但具有可控性和依从性较差等缺陷；
有学者认为，某些药物对MIRI的保护作用与缺血预适应和缺血后适应的机制类似，通过激活机体自身保护机制或促使释放内源性活性物质，进而增强损伤心肌组织对缺血、缺氧的耐受，且药物干预具备时间可控和操作可控的优点。本研究采用GK预处理方式探讨其心肌保护作用，结果表明GK高、低剂量(200、100 mg/kg)均能明显缩小MIRI动物的心肌梗死面积IA/AAR和IA/LVA，提示GK可能是MIRI防治领域的候选药物之一。
MIRI所涉及的病理生理机制极为复杂，包括氧化应激、炎症反应、能量代谢障碍、钙超载等。近年来“细胞凋亡学说”受到重视，有学者认为，心肌细胞凋亡异常也是MIRI过程中一种重要的病理机制。生理条件下，细胞凋亡有助于维持细胞增殖和细胞死亡间的平衡；
MIRI发生时，冠脉再灌注不仅给缺血心肌组织提供赖以生存的氧气和葡萄糖，同时也为细胞凋亡提供了能量，此时凋亡可诱导过度的细胞死亡，导致不可逆的心肌损害，降低心功能。如何有效减轻再灌注后的细胞凋亡，保护受损的心肌，是MIRI的一个治疗方向。据报道，临床为心肌梗死患者行再灌注治疗时，再灌注时间越晚，心肌细胞凋亡现象越明显；
动物实验研究亦表明，MIRI大鼠心肌组织凋亡细胞显著增多，缺血再通区域以凋亡细胞为主；
大鼠冠脉缺血6 h后的心肌细胞凋亡指数最高，凋亡关键蛋白caspase-3、caspase-8活性在缺血3 h开始升高，6 h达高峰。本研究发现，冠脉结扎45 min再灌注6 h后，MIRI大鼠心肌细胞凋亡率与假手术大鼠比较显著增高，证实细胞凋亡是MIRI过程的重要参与者；
GK高、低剂量组明显降低大鼠心肌细胞凋亡率，提示GK预处理通过抑制凋亡反应，可减轻MIRI过程中心肌损伤，改善心功能。
由细胞表面死亡受体Fas介导、半胱氨酸蛋白酶caspase-8直接参与的死亡受体信号途径是重要的外源性凋亡通路。当受到缺血、再灌注等外因诱导时，存在于心肌细胞表面的Fas与其死亡配体Fas-L结合，继而与胞内Fas相关死亡结构结合，募集caspase-8形成死亡诱导信号复合体，并将细胞外的促凋亡信号传入胞内，启动caspases级联反应，最终激活凋亡执行因子caspase-3而引发心肌细胞凋亡。既往研究亦已证实Fas、Fas-L、caspase-8及caspase-3在MIRI进程中发挥重要作用。本研究发现，模型组大鼠心肌组织Fas、Fas-L基因表达及caspase-3、caspase-8活性较假手术组明显上调，提示冠脉缺血45 min再灌注6 h后，死亡受体信号途径被激活并参与了MIRI的病理进程；
GK高、低剂量组可明显抑制Fas、Fas-L基因表达及caspase-3、caspase-8活性，说明GK预处理通过抑制死亡受体信号途径的活化，减轻MIRI过程中的心肌细胞凋亡反应。
总之，GK预处理对MIRI的心肌保护作用与影响Fas介导的死亡受体信号途径、抑制心肌细胞凋亡反应等有关。鉴于凋亡通路的复杂性和多样性，其具体作用环节尚有待于进一步研究。
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