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魏红芳，刘 昆，姬向波，唐桂芬，李卫兵，唐杏雨，刘颖慧，郭建来*
（1.河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州 450045；
2.河南牧业经济学院河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室，河南郑州 450045；
3.郑州普恩科技有限公司，河南郑州 450001）
以往，养殖生产中常在饲料中添加抗生素以促进动物生长和减少疾病的发生。但使用抗生素会导致畜产品抗生素的残留，带来食品安全隐患和环境污染。我国已于2020 年7 月1 日全面禁止饲料端添加促生长类抗生素。因此，研究开发具有促生长、增强免疫力和改善肠道健康等功效的功能性产品已成为当前动物营养领域研究的热点。
黑水虻是一种营腐食性昆虫，也是一种极具应用前景可资源化利用的昆虫。黑水虻幼虫不仅富含蛋白质和脂肪，还含有月桂酸和抗菌肽等成分，具有较高的营养价值以及调控动物机体抗氧化和免疫状态的功能。但因其含水量高达65.0%～75.0%（本实验室检测），不便于运输和储存，因此对黑水虻幼虫通常采用微波烘干的加工方式。研究表明，在日粮中适量添加黑水虻虫粉替代豆粕或者鱼粉可改善动物的生产性能，并对肉品质、肠道微生物、肠道代谢和黏膜免疫具有有益的调控作用。但这种加工方式成本较高，从饲料成本角度考虑并不划算。因此，进一步对黑水虻幼虫的加工工艺进行探索，提高其应用效果，是黑水虻幼虫饲料化的研究方向之一。本试验旨在通过微生物发酵技术来处理黑水虻幼虫，为黑水虻幼虫加工工艺的探索和功能性产品的开发提供技术依据。
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 黑水虻幼虫和麸皮由郑州普恩科技有限公司提供，乳酸对照品为北京索莱宝科技有限公司产品，氨基酸对照品为北京镭欧森科技发展有限公司产品，MRS 培养基为北京奥博星生物技术有限责任公司产品；
除乙腈和甲酸为色谱纯外，其他试剂均为分析纯。
1.1.2 试验菌种 益生菌发酵剂A 内含枯草芽孢杆菌和酿酒酵母，其中枯草芽孢杆菌菌落数≥5×10CFU/g，酿酒酵母活细胞数≥2×10个/g；
益生菌发酵剂B 内含植物乳杆菌，菌落数≥2×10CFU/g，发酵剂为广州博善生物科技股份有限公司产品。
1.2 发酵饲料制备 将黑水虻幼虫（含水量65.0%～75.0%）与麸皮（含水量13.0% 左右）1:1 混合，益生菌发酵剂A 和发酵剂B 各取0.2% 溶解于温水中，在35℃温水中活化2 h，然后加入饲料中搅拌均匀（物料含水量最终控制在38.0%～40.0%），制成固体发酵饲料。发酵饲料用带有单向排气呼吸阀的PE 膜密封包装，每袋1.0 kg，共做54 袋，在35℃人工气候箱中发酵。试验于2021 年7—8 月在河南省非常规饲料资源创新利用重点实验室进行。
1.3 样品处理及指标测定
1.3.1 样品处理 在前期预试验发现发酵1 d 后pH 从8.7左右下降5.8 左右，下降幅度较大。因此，发酵0～24 h每隔4 h 取样1 次，每次随机抽取3 袋，随后第2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20 天各取样1 次，每次随机抽取3 袋，检测各项指标。
1.3.2 乳酸菌活菌数及pH 乳酸菌采用MRS 固体培养基培养并计活菌数；
pH 采用上海仪电PHS-3C 雷磁精密pH 计测定；
乳酸采用山东悟空K2025 高效液相色谱仪测定，依据《发酵饲料中乳酸含量的测定》（T/NAIA002-2020）。
1.3.3 主要营养成分 样品采用105℃烘箱干燥，参照《饲料中水分的测定》（GB/T 6435-2014）测定水分；
灰分采用上海灯晟DTM-4A-12 陶瓷纤维马弗炉测定，参照《饲料中粗灰分的测定》（GB/T 6438-2007）；
总能采用TYHW-2000 型微机全自动量热仪测定，参照《动物饲料、动物产品和粪便或尿液 总热值的测定 弹式量热计法》（ISO 9831，1988）；
粗纤维采用ANKOM200 纤维分析仪测定，参照《饲料中粗纤维测定方法》（GB/T 6434-2006）；
粗蛋白质采用山东海能K9840 自动凯氏定氮仪测定，参照《饲料中粗蛋白质的测定》（GB/T 6432-2018）；
粗脂肪采用山东海能全自动粗脂肪测定仪SOX606 测定，参照《饲料中粗脂肪的测定》（GB/T 6433-2006）；
钙采用乙二胺四乙酸二钠络合滴定法测定，参照《饲料中钙的测定》（G B/T 6436-2018）；
总磷采用北京莱伯泰科UV Power 紫外可见分光光度计测定，参照《饲料中总磷的测定 分光光度法》（GBT6437-2002）；
氨基酸采用德国曼默博尔A300 氨基酸自动分析仪测定，参照《饲料中氨基酸的测定》（GB/T 18246-2000），计算17 种氨基酸总量。
1.3.4 多肽含量 准确称取发酵饲料湿样2.00 g，加入15% 三氯乙酸（TCA）溶液 50 mL，混合均匀，静置5 min，以中速定性滤纸过滤，将滤液转移置离心管，4 000 r/min 离心10 min，准确移取上清液10 mL 于消化管中，按粗蛋白质测定方法测定其多肽含量，具体操作和计算参照《饲料中粗蛋白质的测定》（GB/T 6432-2018）。
1.4 统计分析 试验数据用Excel 2016 软件进行处理并绘制图表。
2.1 发酵时间对黑水虻发酵饲料pH 的影响 由图1 可见，发酵0～8 h，发酵饲料的pH 变化较小；
8～16 h，pH 随时间延长而迅速下降；
16 h 以后，pH 趋于稳定。由图2 可知，发酵初始pH 在8.70 左右，24 h 后pH 下降到5.85 左右，发酵1 d 以后至试验结束pH 波动较小；
从本试验来看，在35℃发酵条件下，发酵的前24 h 乳酸菌产生乳酸的速度最快，随后产酸能力降低。
图1 0～24 h 发酵饲料pH 变化情况
图2 发酵过程中pH 的变化
2.2 发酵时间对黑水虻发酵饲料乳酸菌活菌数和乳酸含量的影响 由图3 可见，发酵第2 天总乳酸菌数达到顶峰，为8.8×10个/g。随后乳酸菌数开始下降，发酵第9 天到本试验结束，黑水虻发酵饲料中的乳酸菌数趋于稳定，维持在6.8×10个/g 左右。乳酸菌在繁殖过程中会产生大量的乳酸，发酵第2 天乳酸含量由开始时的0.42%迅速增加到5.15%，随后乳酸含量缓慢增加，至试验结束，发酵料中乳酸含量达到了5.98%。
图3 发酵过程中乳酸和乳酸菌活菌数的变化
2.3 发酵过程中成分变化分析 如图4～7 所示，随着发酵时间的延长，发酵饲料的水分含量略有增加；
干物质中粗蛋白质、粗灰分、粗脂肪和粗纤维与发酵前相比略有增加；
发酵0 d 时多肽含量为3.04%，发酵4 d 时达到了7.79%，随后缓慢增加，但增幅较小。
图4 发酵过程中水分、粗蛋白质和氨基酸总量的变化
图5 发酵过程中多肽和总能的变化
图6 发酵过程中粗脂肪和粗纤维的变化
图7 发酵过程中粗灰分、钙和总磷的变化
3.1 黑水虻幼虫发酵过程中乳酸菌活菌数和乳酸含量的变化 林标声等用复合益生菌发酵常规饲料，发酵144 h时活菌总数达到峰值，随后总菌数开始下降；
孙合美等用植物乳杆菌和戊糖片球菌的混合菌种发酵饲料，48 h 时乳酸菌活菌数达到最高值，为6.8×10CFU/g。本试验也发现，在固体发酵黑水虻幼虫第2 天时，乳酸菌活菌数量达到顶峰，为8.8×10个/g，乳酸含量达到5.15%；
此后，随着发酵时间的延长，乳酸菌活菌数开始减少，到发酵第9 天，黑水虻发酵饲料中的乳酸菌活菌数趋于稳定。本研究中复合益生菌由乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母组成，枯草芽孢杆菌属于好氧菌，酿酒酵母属于兼性厌氧菌，各菌株生长时所需的条件不同。在制作发酵饲料过程中，发酵袋中会残存一部分氧气，可供芽孢杆菌和酵母菌生长和快速繁殖，此时乳酸菌基本不生长。当发酵袋内氧气耗尽时，乳酸菌开始快速繁殖，并产生大量乳酸。随着乳酸的大量产生，发酵饲料的pH 下降，酸性环境不再适合菌株的生长，部分菌种开始裂解，乳酸菌数开始下降。
3.2 复合益生菌发酵黑水虻幼虫对主要营养成分的影响本试验结果表明，与发酵前相比，黑水虻幼虫经复合益生菌固体发酵后的粗蛋白质、粗灰分、钙、总磷及氨基酸总量略有增加，可能与发酵饲料干物质减少有一定关系。酵母菌属兼性厌氧菌，在有氧条件下，把糖分解成二氧化碳和水，在缺氧条件下，酵母菌把糖分解成乙醇和二氧化碳，产生的二氧化碳和乙醇从呼吸阀溢出，发酵物料的总重量降低，烘干后干物质减少。王赫等和刘晓明等也报道，发酵后饲料中粗蛋白质、钙、磷、氨基酸总量高于未发酵饲料。
本试验中发酵饲料的总能较发酵前略有增加，随着发酵时间的延长，总能开始下降。而林标声等试验中发酵饲料经70～75℃烘干，王赫等试验中发酵饲料未经烘干直接检测各项指标。研究结果差异可能与发酵后样品的处理方法有关。本次试验发酵饲料样品经105℃烘干后测定总能，干物质中的粗蛋白质和粗脂肪含量与发酵前相比有所提高，测得的总能也略有提高。
3.3 复合益生菌发酵黑水虻幼虫对多肽含量的影响 肽在动物机体内具有促进养分吸收、参与机体免疫调节、促进肠道发育、提高动物生产性能等作用。饲料原料中多肽含量的增加，对于改善畜禽的健康状况、充分发挥动物生产潜力具有重要意义。方乐等利用芽孢杆菌、酵母菌和中性蛋白酶协同发酵、酶解处理豆粕，多肽含量从11.40 mg/g 提高到199.65 mg/g。林俊宏等利用混合菌固态发酵制备发酵鱼粉，鱼粉发酵后小肽含量达到24.77%。本研究中利用复合益生菌发酵黑水虻幼虫，发酵第2 天多肽含量达到6.55%，随着发酵时间延长，多肽含量仍呈增加趋势。可能是微生物发酵过程中会产生蛋白酶，使黑水虻幼虫中更多的大分子蛋白转化为小分子的肽，增加了多肽含量。从试验结果来看，通过发酵的方式提高黑水虻幼虫中的多肽含量是可行的。
本试验结果表明，在35℃发酵条件下，发酵24 h后黑水虻幼虫发酵饲料的pH 趋于稳定；
发酵第2 天乳酸菌活菌数达到峰值（8.8×10个/g），乳酸含量为5.15%，多肽含量为6.55%，随后乳酸菌数开始下降，乳酸和多肽含量缓慢增加。综合分析，利用复合益生菌发酵黑水虻幼虫可提高发酵饲料中乳酸和多肽的含量，但在动物饲料中的添加剂量、作用效果和作用机理还需进一步深入研究。
