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郭照萌，张 华，张 鹏
（深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院耳鼻咽喉科/深圳市耳鼻咽喉研究所，广东 深圳 518172）
鼻咽癌是一种起源于鼻咽黏膜的上皮性癌，并表现出明显的地理差异，70%的新发病例报告在东亚和东南亚。随着治疗技术的发展，鼻咽癌的发病率和死亡率在过去的几十年呈下降趋势。但是由于鼻咽癌固有的侵袭性和隐匿性，60%～70%鼻咽癌患者被诊断时已是晚期，治疗效果不佳。到目前为止，对于晚期鼻咽癌尚无有效的靶向治疗方法。因此探讨鼻咽癌的转移机制，寻找鼻咽癌的治疗靶点具有重大意义。Orai1是钙库调节钙离子内流的关键分子。近年研究发现在多种肿瘤中Orai1异常表达，并且对维持肿瘤细胞的黏附、增殖、侵袭等恶性表型有重要作用。然而，Orai1是否参与鼻咽癌的进展过程仍未阐明。本研究主要探讨了Orai1对鼻咽癌细胞的转移侵袭和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影响，以期为鼻咽癌的治疗提供新的靶点。
1.1 材料
RPMI-1640培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司；
重组表皮生长因子（recombinant human epidermal growth factor，rEGF）、TRIzol、Lipofectamine3000和Fluo-4 AM购于美国Invitrogen公司；
Transwell小室购于美国Corning公司；
Matrigel基质胶购于美国BD公司；
PrimeScript™RT Reagent Kit和TB GreenFast qPCR Mix购于日本TaKaRa公司；
角质形成细胞无血清培养基、Orai1抗体和Thapsigargin购于美国Sigma公司；
E钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、N钙黏蛋白（Ncadherin）抗体和波形蛋白（Vimentin）抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；
β肌动蛋白（β-actin）抗体购于美国Santa Cruz公司；
PCR引物由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与转染
人鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HONE1和5-8F以及人鼻咽上皮细胞系NP69保藏于深圳市耳鼻咽喉研究所。人鼻咽癌细胞系用含胎牛血清的RPMI-1640培养基，人鼻咽上皮细胞系用含rEGF的角质形成细胞无血清培养基，在CO体积分数为5%、37℃培养箱中培养。靶向Orai1的2种shRNA，Orai1 shRNA-1（5′-CGTGCACAATCTCAACT CG-3′）和Orai1 shRNA-2（5′-CCAGCATTGAGTGTGT ACA-3′），以及对照质粒（无意义序列）均由北京协和药物所王艳博士馈赠。应用Lipofectamine3000试剂进行质粒转染。1.2.2 实时荧光定量PCR
TRIzol提取细胞总RNA，然后用PrimeScript™RT Reagent Kit转录得到cDNA，再进行实时定量PCR：95℃、5 min；95℃、60 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共进行35个循环。引物序列：Orai1上游5′-GCCCTTCGGCCTGATCTTTAT-3′，下游5′-TGGAACTGTCGGTCAGTCTTAT-3′；
E-cadherin上 游5′-GCCTCCTGAAAAGAGAGTGGAAG-3′，下游5′-TGGCAGTGTCTCTCCAAATCCG-3′；
N-cadherin上游5′-CCTCCAGAGTTTACTGCCATGAC-3′，下游5′-GTAGGATCTCCGCCACTGATTC-3′；
Vimentin上游5′-AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA-3′，下 游5′-ATC TGGCGTTCCAGGGACTCAT-3′；
ACTB上游5′-CACC ATTGGCAATGAGCGGTTC-3′，下游5′-AGGTCTTTG CGGATGTCCACGT-3′。以ACTB为内参，采用2法计算相对表达水平。
1.2.3 Western blot
分别提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒检测蛋白含量。取适量蛋白加入上样缓冲液，100℃煮沸10 min。以每泳道20μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，80 V、30 min，120 V、100min。电泳后将蛋白转至PVDF膜，100 V、90 min。电转后PVDF膜用5%BSA室温孵育60 min，孵育相应蛋白的抗体，置于4℃冰箱内摇床过夜。翌日TBST洗涤PVDF膜3次后，加入相应HRP标记的二抗室温孵育120 min，TBST洗涤PVDF膜3次后，加入ECL显影液，进行化学发光。1.2.4 钙库调节的钙离子内流检测
为明确Orai1的表达变化对鼻咽癌细胞钙库调节钙离子内流的影响，采用转染Orai1 shRNA和对照shRNA后检测钙库调节钙离子的内流。操作步骤为：用台式液配制的4μmol/L Fluo-4 AM于培养箱中避光孵育细胞30 min，台氏液洗涤3次后，用无钙离子的台氏液配制的4μmol/L thapsigargin孵育细胞15 min，加入2 mmol/L钙离子观察钙离子内流。Fluo-4荧光信号用激光共聚焦显微镜观察。1.2.5 Transwell转移实验
在24孔细胞培养板中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置入Transwell小室，取1×10/mL细胞悬液200μL接种在Transwell小室上层，然后置于37℃培养箱中培养，16 h后取出Transwell小室，用棉签去除小室上层未转移的细胞，然后在4%多聚甲醛中固定15 min。再将小室置于结晶紫染液中染色，拍照。1.2.6 Transwell侵袭实验
Matrigel与RPMI-1640培养基按1∶8体积比稀释后包被Transwell小室上层，然后置于37℃培养箱中30 min。后续操作同1.2.5。1.2.7 EMT标志蛋白的检测
EMT可促进癌细胞失去细胞极性和细胞间黏附，导致细胞脱离、迁移和侵袭。为明确Orai1是否影响鼻咽癌细胞EMT，应用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染Orai1shRNA和对照shRNA后CNE2细胞中EMT标志蛋白Ecadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白的表达水平，具体操作方法同1.2.2和1.2.3。1.3 数据分析
2.1 Orai1 shRNA转染前后细胞中Orai1的表达水平
结果表明（图1），Orai1在鼻咽癌细胞系及鼻咽上皮细胞中均有表达，且CNE2细胞系中Orai1的mRNA和蛋白表达水平较NP69细胞均显著升高（P
＜0.05），因此，后续实验选择CNE2细胞进行。
图1 Orai1 mRNA和蛋白在鼻咽细胞中的表达
CNE2细胞转染Orai1 shRNA后，采用qPCR和Western blot方法检测Orai1的mRNA和蛋白表达水平，见图2。结果表明，与转染对照shRNA的细胞相比，转染Orai1 shRNA的细胞中Orai1的mRNA和蛋白表达水平均显著下降，差异均具有统计学意义（P
＜0.05）。Orai1 shRNA-1与Orai1 shRNA-2效果相似，后续选择Orai1 shRNA-1进行转染（EMT实验除外）。
图2 敲减CNE2细胞中Orai1的表达
2.2 Orai1对鼻咽癌细胞钙库调节钙离子内流的影响
结果表明，敲减Orai1的表达后可显著降低钙库调节钙离子内流的能力，差异有统计学意义（P
＜0.05），见图3。此结果表明降低Orai1的表达可显著抑制鼻咽癌细胞钙库调节的钙离子内流。
图3 敲减Orai1表达后对CNE2细胞钙库调节的钙内流的影响
2.3 Orai1对鼻咽癌细胞转移和侵袭能力的影响
Transwell转移实验结果见图4，与转染对照shRNA组相比，转染Orai1 shRNA的CNE2细胞转移数量显著降低（P
＜0.05）。另外，我们采用加入了Matrigel的Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果发现，与转染对照shRNA组相比，CNE2细胞转染Orai1 shRNA后细胞侵袭能力显著被抑制，差异有统计学意义（P
＜0.05），见图5。
图4 敲减Orai1表达后对CNE2细胞转移的影响
图5 敲减Orai1表达后对CNE2细胞侵袭的影响
2.4 Orai1对鼻咽癌细胞EMT的影响
结果如图6所示，CNE2细胞转染Orai1 shRNA-1和-2均可显著抑制N-cadherin、Vimentin的mRNA和蛋白表达水平（P
＜0.05），增加E-cadherin的mRNA和蛋白表达水平（P
＜0.05）。提示降低Orai1的表达可显著抑制鼻咽癌细胞的EMT。
图6 敲减Orai1表达后对CNE2细胞EMT的影响
鼻咽癌的病因包括遗传因素、环境因素和EB病毒感染等。虽然放射治疗和化学治疗是鼻咽癌强有力的治疗策略，但大多数鼻咽癌患者在早期诊断时已发生转移，阻碍了有效治疗，导致复发频繁。因此，加深对鼻咽癌发病机制的理解有助于发掘新型转移靶向治疗，改善鼻咽癌患者的预后。虽然Orai1被认为是肿瘤细胞转移的重要因素，但其在鼻咽癌细胞中的作用机制尚不清楚。本研究证实Orai1影响鼻咽癌细胞的转移侵袭，并可能与EMT相关。因此，研究Orai1调控鼻咽癌细胞转移的分子机制，将为早期干预鼻咽癌转移提供新的方向。
虽然近年来对肿瘤转移的认识有了较大的进展，但钙离子在肿瘤转移中的作用仍不清楚。钙离子是一种多功能的第二信使，调节细胞的许多生理和病理过程。钙离子通过钙调素或其他钙结合蛋白调节细胞内酶活性和蛋白间的相互作用。钙库调节的钙离子内流（store-operated Caentry，SOCE）是钙离子进入非兴奋性细胞的主要方式之一。Orai1是一种位于细胞膜上的钙通道蛋白，在哺乳动物细胞调控SOCE中发挥重要作用。当内质网中的钙储存耗尽后，会激活Orai1，使钙离子快速而短暂地流入细胞质。Orai1作为SOCE的重要组成部分，研究表明Orai1促进黑色素瘤、乳腺癌和肠癌细胞的转移，我们前期的研究亦表明Orai1在缺氧微环境下通过调节SOCE促进乳腺癌的迁移。Orai1在多种肿瘤中高表达，包括非小细胞肺癌、食管癌和胃癌。我们的研究结果与之前的报道一致，在本研究中发现Orai1在鼻咽癌细胞CNE1、CNE2、HONE1和5-8F中的表达明显高于人鼻咽上皮细胞NP69。这些结果提示Orai1可能参与了鼻咽癌的发生发展。最近的研究表明，SOCE在各种恶性肿瘤进展中起着重要作用。为了验证Orai1在鼻咽癌细胞中调控SOCE的作用，我们选择靶向Orai1的特异性shRNA降低Orai1在CNE2细胞中的表达。进一步研究发现，敲减Orai1的表达可以显著抑制鼻咽癌细胞钙库调节的钙离子内流。提示Orai1可能是调控鼻咽癌细胞恶性发展的关键因子，并且在鼻咽癌细胞中正向调控SOCE。为了证实Orai1调控鼻咽癌细胞侵袭的作用，我们通过转染Orai1 shRNA抑制鼻咽癌细胞中Orai1表达后，发现鼻咽癌细胞的转移和侵袭受到抑制，说明抑制Orai1表达可抑制鼻咽癌细胞的转移和侵袭，提示Orai1可能通过SOCE调节鼻咽癌细胞的转移和侵袭。
鼻咽癌的死亡率主要是由于肿瘤细胞从原发肿瘤向局部淋巴及远处器官的侵袭和转移。多数实体癌起源于上皮细胞，上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）被认为是上皮细胞获得运动能力的重要过程。尽管EMT最初是在胚胎发育期间被发现，但越来越多的研究表明EMT可导致间质细胞标记物的获得和上皮标记物的丢失，进而增强癌细胞的迁移和侵袭能力，促进肿瘤的进展。研究表明，E-cadherin调控细胞黏附，低表达E-cadherin促进细胞脱离原位点，相反，N-cadherin和Vimentin与肿瘤侵袭性增加呈正相关，而这一过程已被证明与钙离子内流有关。钙离子作为第二信使通过影响各种基因、蛋白质和信号通路调节细胞多种功能。相关研究已经证实多种类型的癌细胞中钙离子通道和参与钙离子稳态的分子具有显著的表达失调。研究显示，Orai1在胃癌细胞中表达升高，降低Orai1可抑制胃癌细胞EMT和转移。降低前列腺癌PC-3细胞的Orai1表达，可显著抑制EMT以及细胞运动、迁移及侵袭能力。但是Orai1在鼻咽癌细胞EMT相关的转移中是否发挥作用，依然不明确。本研究得到了相似的结果，在鼻咽癌细胞CNE2中降低Orai1的表达后，E-cadherin的表达降低，而N-cadherin和Vimentin的表达升高，抑制鼻咽癌细胞EMT。本研究结果提示降低Orai1表达可能通过抑制EMT过程，阻碍鼻咽癌细胞的转移和侵袭。
综上所述，鼻咽癌细胞中Orai1呈高表达，降低Orai1表达可抑制鼻咽癌细胞的转移和侵袭，其可能通过负调控SOCE和EMT发挥作用。因此，深入研究Orai1在鼻咽癌细胞转移中的分子机制，有望发掘鼻咽癌靶向治疗的新靶点。
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