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杨梦佳，韩晓江，王 涛，张 念
（商洛学院健康管理学院，陕西 商洛 726000）
木耳（Auricularia auricula），又称黑菜、桑耳、本菌、树鸡等，是一种药食同源真菌，不仅可以食用，还可以作为药用，营养丰富且具有很好的保健效果，被称为“黑色瑰宝”和“人体的清道夫”[1-4]。其主要生理活性成分是木耳多糖，具有较强的抗氧化性[5]，还可以抗肿瘤[6]、抗溃疡、抑菌[7]、抗衰老、降血糖[8]、降血脂[9]、提高机体免疫力，对人体组织有一定的保护作用。秦岭山区之中，独特的气候条件生长出的黑木耳不仅作为“小木耳，大产业”助力脱贫致富，更赋予了该地区黑木耳独特的口感、营养价值、生理活性等[10-11]。
通过热水浸提辅助超声波提取木耳多糖，经响应面优化最佳工艺得到提取木耳多糖的最佳工艺参数，同时对当地提取的木耳多糖进行抗氧化研究，为秦岭地区黑木耳食物资源的开发利用提供一定的科学依据。
1.1 材料与试剂
陕西秦岭特产柞水黑木耳；
葡萄糖标准品，北京奥博星生物技术有限责任公司提供；
苯酚（5%苯酚溶液）、浓硫酸、无水乙醇等，均为分析纯。
1.2 仪器与设备
DFY-500C 型摇摆式高速粉碎机，温岭市林大机械有限公司产品；
721 型可见光分光光度计，上海菁华科技有限公司产品；
TD4-WS 型低速离心机、HH-S4 型四孔恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司产品；
KQ3200DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品。
1.3 试验方法
1.3.1 木耳多糖提取工艺
将从秦岭深处柞水购买的黑木耳除去杂质，烘干后密封保存。
黑木耳→烘干→粉碎→热水浸提（超声辅助）→抽滤→浓缩→5%苯酚溶液→浓硫酸→蒸馏水定容→冷却→测定。
1.3.2 单因素试验
根据参考文献[12-16]，结合试验研究，最终确定超声时间20 min，超声温度60 ℃，浸提温度80 ℃，浸提时间60 min，研究料液比分别为1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80 时对多糖提取率的影响。
确定料液比为1∶60，超声温度为60℃，浸提时间为60 min，浸提温度为80 ℃。同时，超声时间单因素试验条件定为10，20，30，40，50 min。
确定料液比为1∶60，浸提时间为60min，超声时间为20min，浸提温度为80℃。同时，超声温度分别设置为20，30，40，50，60 ℃。
确定料液比为1∶60，超声时间为20 min，浸提时间为60 min，超声温度为60 ℃。同时，设置浸提温度分别为50，60，70，80，90 ℃。
确定料液比为1∶60，超声时间为20 min，浸提时间为60 min，超声温度为60 ℃。同时，设置浸提时间为 15，30，45，60，75 min。
1.3.3 响应面法优化
通过单因素试验，确定了提取木耳多糖的最佳料液比为1∶60，最佳热水浸提时间为80 ℃。利用响应面法设计试验，试验因素确定为超声时间、超声温度、浸提时间。水平设置为三水平，超声时间分别为40，50，60 min；
超声温度分别为20，30，40 ℃；
浸提时间设置为75，80，85 min。
1.3.4 多糖提取率计算公式
本试验采用硫酸－苯酚法[17-18]测定多糖的含量。
式中：C——由标准曲线得到的木耳多糖的质量浓度，mg/mL；
V——定容后的体积，mL；
N——溶液最终的稀释倍数；
m——木耳粉质量，g。
1.3.5 木耳多糖的抗氧化性
试验采用体外方法1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼（DPPH 法） 测多糖的抗氧化性[19-20]。
配制DPPH 溶液。准确称取0.8 mg 的DPPH 试剂，溶液用无水乙醇，溶解DPPH 试剂并定容至100 mL 的棕色容量瓶中，得到浓度为0.008 mmoL/L的DPPH 溶液，放入冰箱中避光保存。
取浓度为 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL的木耳多糖溶液1 mL 放入具塞试管里，再加3 mL DPPH 溶液，避光反应20 min，用无水乙醇作空白，于波长517 nm 处测吸光度。
1.4 数据分析
单因素曲线采用Excel 处理，响应面使用Design Expert 11 软件处理[21-22]。
2.1 单因素试验
2.1.1 料液比对多糖提取率的影响
料液比对多糖提取率的影响见图1。
图1 料液比对多糖提取率的影响
由图1 可知，木耳多糖的提取率随着料液比的增加先增加后下降，最低提取率为22.29%时，料液比为1∶40；
最高提取率为22.41%时，料液比为1∶60，极差是0.12%。经过料液比的单因素试验，可以确定出在该试验中提取秦岭黑木耳多糖的最佳料液比为1∶60。
2.1.2 超声时间对多糖提取率的影响
超声时间对多糖提取率影响结果见图2。
由图2 可知，木耳多糖的提取率随着超声时间的增加呈上升趋势，但在20～50 min 时多糖提取率的增加偏缓，只有在超声时间由10 min 变为20 min时，多糖的提取率有显著的提升，随着超声时间延长，可能会有其他杂质随着多糖一起流入溶液中，影响多糖的测定。在不同超声时间下，作为响应面法研究的影响木耳多糖提取率的单因素之一，以此确定最佳的超声时间。
图2 超声时间对多糖提取率影响结果
2.1.3 超声温度对多糖提取率的影响
超声温度对多糖提取率影响结果见图3。
图3 超声温度对多糖提取率影响结果
由图3 可知，超声温度为20～50 ℃时木耳多糖的提取率直线下降。超声温度为60 ℃时，木耳多糖的提取率又突然升高，这种现象的发生可能是因为超声温度越高，对细胞的破坏性就越大，细胞中的多种内容物就融入到了溶液中，导致测多糖溶液的吸光度突然升高。同时，考虑和其他因素的交互作用，选择多糖提取率最高的3 个温度进行响应面优化试验，以此确定超声温度提取黑木耳多糖的最佳温度。
2.1.4 浸提温度对多糖提取率的影响
浸提温度对多糖提取率影响结果见图4。
图4 浸提温度对多糖提取率影响结果
由图4 可知，浸提温度为80 ℃时，木耳多糖的提取率达到最高，为23.64%。浸提温度对多糖提取的影响趋势有规律可循，选择水提法的浸提最佳温度为80 ℃。
2.1.5 浸提时间对多糖提取率的影响
浸提时间对多糖提取率影响结果见图5。
图5 浸提时间对多糖提取率影响结果
由图5 可知，热水提取黑木耳多糖时对黑木耳多糖的提取率影响很大，但没有规律可循。当浸提时间为30～60 min 时，多糖提取率突然降低，当浸提时间为75 min 时，多糖提取率突然上升，不能确定随着时间延长多糖得率变化趋势，但浸提时间对多糖提取率极差在0.2%以内，考虑因素交互作用，选择浸提时间作为响应面法因素进行优化。
2.2 响应面法试验结果与分析
2.2.1 响应面试验结果
响应面分析试验设计表1。
表1 响应面分析试验设计
通过单因素试验，其中有2 个因素的试验结果显著，即料液比1∶60，提取温度80℃，其余3 个因素超声时间、超声温度和浸提时间有待进一步确定。单因素试验结果表明，超声时间在50 min 时，木耳多糖的提取率最高，所以在设计响应面试验时，超声时间设置为50 min 左右2 个水平，即40，50，60 min。超声温度和浸提时间水平选择原理一样，但由于超声波清洗仪温度设置太低容易受到室内温度的影响，因此选择超声温度为20，30，40 ℃。通过响应面法设计试验，共设计17 组试验。
响应面分析试验设计见表2。
表2 响应面分析试验设计
用Design Expert 11 软件对试验数据进行统计分析，得到以下回归方程：
为了检验黑木耳多糖提取工艺的回归模型有效性，对该模型进行检验和方差分析（见表3）。该回归模型的p＜0.01，表明这个回归模型极显著，并且失拟项p=0.112 9＞0.05，表示不显著，说明该模式成立。可以用该模式进行木耳多糖的最佳工艺优化。
方差分析结果见表3。
表3 方差分析结果
2.2.2 响应面因素交互作用分析
任意两因素之间的相互作用结果见图6。
图6 任意两因素之间的相互作用结果
响应面的等高线颜色从蓝变红表示提取的物质含量由少到多，2 个因素的相互作用越大，等高线形成的形状越趋近椭圆，离心率就越大。等高线所形成的椭圆越扁，则表明这2 个因素的交互作用越明显。由图6 可知，超声时间和浸提时间相互作用的等高线形状是椭圆形，说明这2 个因素的交互作用较大，超声时间和超声温度的交互作用不是很明显。木耳多糖的影响因素还可以通过观察曲线的走势来判断。曲线的走势越陡，说明该因素对木耳多糖的提取率越大，反之则越小。由图6 可知，影响木耳多糖提取含量的重要因素是超声温度，其次是浸提时间，最后是超声时间。这个结果和表3 一致。由响应面法回归模型预测的木耳多糖的最佳提取工艺条件为超声温度26.813 ℃，浸提时间75.776 min，超声时间50.856 min，最大的多糖提取率预测为25.302%。为了验证试验操作方便快捷，将响应面法模型优化的提取条件设置为整数，即超声温度26 ℃，浸提时间75 min，超声时间50 min。在改变条件的情况下，进行3 次平行验证试验，3 次木耳多糖提取率的平均结果是24.95%，与模型预测的结果相差不大。因此，试验模型可以较好地模拟和预测木耳多糖的浸提率和最优条件。
2.3 木耳多糖抗氧化性结果与分析
木耳多糖对DPPH 自由基清除率见图7。
图7 木耳多糖对DPPH 自由基清除率
由图7 可知，木耳多糖有一定的抗氧化性，其抗氧化能力随多糖含量的提高而提高，与现在有文献的结论基本一致[23]。在木耳多糖质量浓度达到1 mg/mL 时，对自由基的清除率高达60.4%。木耳多糖的抗氧化性的发现和研究可以使木耳的销路更好，使木耳的产业链更加完整，可将其加入到保健食品中，对缓解人体的衰老速度具有积极的意义。
在单因素试验的基础上采用响应面法对木耳多糖的最佳提取工艺条件进行研究，响应面法回归模型预测木耳多糖的最佳提取工艺条件为超声时间50.856 min，超声温度26.813 ℃，浸提时间75.776 min，最大的多糖提取率预测为25.302%。为了验证试验操作方便快捷，将响应面法模型优化的提取条件设置为整数，即超声温度26 ℃，浸提时间75 min，超声时间50 min，进行3 次平行验证试验，3 次木耳多糖提取率的平均结果为24.95%，与模型预测的结果相差不大。木耳多糖的抗氧化性采用DPPH 法对其进行测定，不同质量浓度的多糖溶液的抗氧化性不同，质量浓度越大，抗氧化性越强。当木耳多糖的质量浓度达到1 mg/mL 时，对DPPH 自由基的清除率达到60.4%。
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