TRIM,59在结直肠癌中的表达及其与临床病理指标的关系

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高晓斌，武雪亮*，王胜杰，孙光源，王文静，梁 峰，赵轶峰，刘振显，张迎春

（河北北方学院附属第一医院普通外科，河北 张家口 075000）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病亡率分别位于所有肿瘤的第3位和第4位，且发病率呈逐年上升和年轻化趋势。近年来，随着我国居民生活方式、饮食结构和生存环境的改变，我国结直肠癌发病率呈持续上升趋势，2014年我国居民结直肠癌发病例数位居所有肿瘤第3位。尽管结直肠癌的诊断与治疗已经取得了长足的进步，但由于在早期筛查、早期诊断上的诸多困难，部分患者失去了最佳治疗时期，其整体5年生存率并未明显提高，较欧美国家仍有较大差距。因此，对它进行深层次的研究，从分子生物学角度阐明结直肠癌的发病机制，寻求敏感度高、特异性强的标志物已成为结直肠癌的研究热点。三结构域蛋白家族（tripartite motif，TRIM）是一个结构相对保守的蛋白家族，拥有E3泛素化连接酶活性，在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等恶性进程中发挥重要作用。目前已有研究发现TRIM59在乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤中表达上调并促进肿瘤细胞恶性进展，然而TRIM59的表达水平与结直肠癌的关系目前鲜有报道。因此，本研究拟检测TRIM59在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达，分析其表达与结直肠癌患者临床病理指标及预后的相关性，旨在为结直肠癌诊断、分子治疗的研究提供理论基础。

1.1 病例资料

收集2015年2月—2016年2月河北北方学院附属第一医院普通外科收治的86例结直肠癌患者的临床资料，选取癌组织和相应的癌旁正常组织手术切除标本。86例结直肠癌患者中，男47例，女39例；
年龄40～79岁，中位年龄64岁，小于65岁的38例；
直肠癌45例，结肠癌41例。所有纳入患者临床资料均完整，本研究经河北北方学院附属第一医院伦理委员会批准通过，所有研究对象均签署知情同意书。病例纳入标准：①行CRC根治性手术并且术后病理明确诊断为结直肠癌；
②临床资料完整，术后留存组织学标本。排除标准：①伴有其他恶性肿瘤者；
②临床资料不全或难以配合取材者；
③伴有严重心、肝、肾功能异常者；
④新辅助放化疗患者。术后随访主要通过门诊复诊、电话及网络等方式对所有患者进行随访调查，随访时间为60个月，了解患者术后死亡时间及原因，所有纳入研究的患者均获得随访数据。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂

TRIzol提取试剂购于Sigma公司；
反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；
PCR引物由上海生物工程技术公司设计并合成；
TRIM59多克隆抗体购自美国Abcam公司；
SP法免疫组化试剂盒、苏木素染料及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 实时荧光定量PCR法检测TRIM59 mRNA表达

使用总RNA提取试剂抽提组织中的总RNA，测定总RNA浓度。根据反转录试剂盒两步法合成cDNA，反应体系按说明书要求配制，然后进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）扩增。引物序列如下：TRIM59上游5′-ATGGCCGATGACGTAATC GCG-3′，下游5′-CGTGAGCTCACCATGGATCAG-3′；
GAPDH上游5′-TCCCTCGTGCTAGATCATGAA-3′，下游5′-GGTCATGATCAGCCACTGTC-3′。PCR反应条件为：95℃、10 min；
95℃、15 s，60℃、35 s，72℃、30 s，进行35个循环；
于72℃延伸7 min。mRNA表达量采用2计算。

1.2.3 免疫组织化学法检测TRIM59蛋白表达

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidinperosidase，SP）法检测TRIM59蛋白的表达水平。石蜡块使用二甲苯脱蜡，作3.5μm厚的连续切片，80℃烤箱烘烤30 min，脱水；
抗原热修复，3%过氧化氢孵育，血清封闭；
滴加兔抗人TRIM59多克隆一抗孵育过夜；
加入生物素标记二抗孵育1 h。最后使用DAB显色30 s，苏木精复染，松节油透明和树胶行封片处理，最后置于光镜下观察。

免疫组化的结果判读是由两名病理科医师进行双盲读片，根据阳性细胞比例评分与细胞染色强度分值乘积进行半定量分析，镜下随机选取5个高倍镜视野（×400），每个视野计数100个肿瘤细胞。阳性细胞染色强度评分：无细胞染色为0分，浅黄色颗粒为1分，黄色颗粒为2分，褐色颗粒为3分。阳性细胞所占比例评分：阳性细胞数≤10%为0分，10%～25%（含）为1分，25%～50%（含）为2分，＞50%为3分。阳性细胞染色强度评分和比例评分的乘积≥4分判定为高表达，＜4分判定为低表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0进行统计学分析，采用GraphPad Prism 7软件作图，用均数±标准差表示计量资料，组间比较采用配对样本

t

检验；
用百分率（%）表示计数资料，采用

χ

检验。采用Kaplan-Meier分析和Log-rank法检验结直肠癌患者TRIM59表达水平与预后的关系，

P

＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 TRIM59 mRNA和蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达

采用qPCR检测配对的结直肠癌及癌旁组织中的TRIM59 mRNA表达水平，结果表明，TRIM59在结直肠癌组织中表达水平较配对的癌旁组织明显升高，差异有统计学意义（

t

=12.86，

P

＜0.01），其中25对配对样本的表达情况见图1。免疫组化检测结果表明，TRIM59蛋白主要定位于肿瘤细胞质和细胞核内，染色呈棕黄色和黄褐色，而在癌旁组织中不表达或在正常黏膜细胞胞质内呈弱阳性表达，见图2。TRIM59蛋白在结直肠癌组织中的阳性表达率为62.79%（54/86），在癌旁组织中的阳性表达率为32%（37/86），两组比较差异有统计学意义（

χ

=6.74，

P

＜0.01）。

图1 TRIM59 mRNA在结直肠癌及癌旁组织中的表达

图2 免疫组化检测TRIM59蛋白在结直肠癌及癌旁组织中的表达（SP，×200）

2.2 TRIM59蛋白表达与结直肠癌患者临床病理指标的关系

TRIM59蛋白表达水平与结直肠癌临床病理指标的相关性分析结果见表1。结直肠癌组织中TRIM59蛋白表达水平与结直肠癌患者的TNM分期（

χ

=8.515，

P

=0.003）、肿瘤浸润深度（

χ

=7.167，

P

=0.007）以及淋巴结转移情况（

χ

=5.511，

P

=0.018）相关，而其与患者的性别、年龄、远处转移及肿瘤分化程度均无显著相关关系（

P

＞0.05）。

表1 TRIM59蛋白表达水平与结直肠癌患者临床病理指标的相关性

2.3 TRIM59蛋白表达与结直肠癌患者生存期的关系

通过Kaplan-Meier分析TRIM59蛋白表达与结直肠癌预后的关系，结果见图3。可见TRIM59高表达组患者的总生存期（overall survival，OS）和无病生存期（disease-free survival，DFS）较TRIM59低表达患者显著缩短（

P

＜0.01或0.05），即TRIM59蛋白表达水平越高，结直肠癌患者预后越差。

图3 TRIM59蛋白表达与结直肠癌患者术后预后的相关性分析

TRIM59属于TRIM蛋白超家族成员之一，其编码基因位于人类第3号染色体上。TRIM59结构包含高度保守的RBCC三段结构域和涉及蛋白跨膜定位的TM结构域，其主要功能是参与调控TRIM59细胞内定位。TRIM59主要位于细胞内质网膜上，通过介导蛋白与蛋白间的相互作用，调控蛋白稳定性，进而促进肿瘤细胞的无序化增殖，促进肿瘤发生。较多研究表明，TRIM59在多种实体肿瘤中充当癌基因，在恶性肿瘤的侵袭、迁移、增殖和凋亡等过程中发挥重要作用。最近研究报道，TRIM59在食管癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中表达上调，并且可通过多种信号通路或途径参与肿瘤的恶性进展。因此，进一步提高对

TRIM59

基因研究的认识，有望为肿瘤早期诊断和治疗提供新靶点。

研究报道，TRIM59在非小细胞肺癌中的表达明显上调，其表达与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟状态、肿瘤分期、淋巴结转移和病理分期密切性相关。此外，Cox回归分析结果表明TRIM59是NSCLC的独立预后因子。以上表明TRIM59可作为非小细胞肺癌预后的独立预测指标和潜在的治疗靶点。

有学者研究发现，TRIM59在胰腺癌组织中的表达显著增加，并且其高表达与胰腺癌患者不良预后呈正相关。进一步研究发现，TRIM59可能通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路增强肿瘤细胞的糖酵解，从而促进肿瘤细胞增殖和迁移，进而促进肿瘤进展。Zhou等采用qPCR和Western blot法检测50例胃癌组织和配对胃正常组织中TRIM59 mRNA和蛋白水平，结果表明，胃癌组织中TRIM59 mRNA和蛋白水平较癌旁组织明显升高，且其高表达与胃癌患者生存时间缩短相关。体外实验表明，干扰

TRIM59

基因表达后，胃癌细胞系的增殖、克隆形成和迁移能力明显降低，而过表达TRIM59则反之。TRIM59与p53发生物理作用，增加其泛素化和降解。机制研究表明TRIM59可能通过促进p53的泛素化和降解，进而促进胃癌细胞的增殖和生长。本研究首先采用qPCR技术检测结直肠癌组织及配对的癌旁组织中TRIM59 mRNA表达水平，结果表明，与癌旁组织相比，TRIM59 mRNA在结直肠癌组织中显著高表达。同时，本研究的免疫组化检测结果发现，TRIM59在结直肠癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织。这些结果提示

TRIM59

可能是一个原癌基因，其与结直肠癌的发生与发展密切相关。进一步分析发现，结直肠癌组织中TRIM59蛋白的表达与患者的TNM分期、肿瘤浸润深度以及淋巴结转移密切相关，生存分析表明TRIM59高表达组患者的OS和DFS明显短于低表达组患者，说明TRIM59与结直肠癌的发生发展密切相关，TRIM59高表达提示结直肠癌高侵袭性及不良预后。结合上述结果表明，TRIM59在结直肠癌的发生发展过程中扮演重要的角色，其在结直肠癌中高表达提示患者不良预后，可能对结直肠癌的临床诊疗及预后评估具有一定的参考价值。

总之，本研究发现TRIM59在结直肠癌组织中高表达，并与肿瘤恶性程度和不良预后密切相关，为深入研究结直肠癌的分子标志物以及治疗靶标提供新思路，但本研究仅从mRNA和蛋白水平分析了TRIM59与结直肠癌的临床相关性，TRIM59参与结直肠癌的恶性进展的具体作用分子机制仍需进一步探讨。

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