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李诗言，周钦，柯庆青，王鼎南，周凡，贝亦江，吴洪喜，丁雪燕，王扬
(浙江省渔业检验检测与疫病防控中心， 浙江省水产技术推广总站， 浙江 杭州 310023)
五氯酚(Pentachlorophenol，PCP)化学性质稳定，其钠盐五氯酚钠(Sodium pentachlorophenol，PCP-Na)曾作为高效的除草剂、杀虫剂和木材防腐剂在世界范围内被广泛使用，PCP和PCP-Na已经成为环境中一种常见的持久性有机污染物[1-3]。PCP-Na进入生物体内可转化为PCP，而PCP具有较为复杂的复合生理毒性，包括致癌性、内分泌毒性和遗传毒性等[4-5]，2019年12月农业农村部发布第250号公告[6]，进一步规定了食品动物中不得检出PCP-Na。PCP及PCP-Na作为一种难降解的有机污染物，可以通过食物链传递在生物体内富集，引发潜在的食品安全问题，且近几年水产品中PCP-Na残留的报道时有发生[7-10]，因此长期开展水产品中PCP及其钠盐残留的监测非常必要。
动物源性食品中PCP-Na(以PCP计)的检测方法报道较多，其中液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)因特异性强，灵敏度高，且前处理无需衍生，已经成为动物源性食品中PCP-Na残留的主要检测方法[11-13]。目前，关于动物源性食品中PCP-Na的样品前处理手段主要采用传统的固相萃取(Solid phase extraction, SPE)方法，该类前处理步骤繁琐，易受复杂基质特别是高脂基质样品的干扰[14]。相比其他动物源性食品，水产品物种跨度大，基质差异性明显，对检测方法适用性要求更高。Captiva EMR-Lipid(以下简称EMR)小柱可通过体积排阻和疏水作用吸附脂类等长链物质达到净化目的，操作步骤简便，基质适用性较强，已经成功在动物源性样品的药物残留和毒素检测中得到应用[15-16]。本试验以EMR小柱为净化手段，建立了水产品中PCP-Na(以PCP计)的高效液相色谱串联质谱检测方法，并对包括中华鳖(Trionyxsinensis)和海水贝类在内的水产品基质进行验证，以满足水产品多种基质中PCP-Na快速检测工作的需要。
1.1 仪器与试剂
实验仪器主要包括：ExionLCTMAD超高效液相色谱仪(美国 SCIEX 公司)；
4500 Qtrap 三重四级杆质谱仪(美国 SCIEX 公司)；
Multi Reax振荡器(德国 Heidolph 公司)；
Allegra X-12高速离心机(美国 BECKMAN 公司)；
N-EVAP112水浴式氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates 公司)。
实验中用到的标准物质包括：五氯酚钠标准溶液(100 μg/mL，农业农村部环境保护科研监测所)；
13C6-五氯苯酚标准品(纯度≥97%，First Standard 公司)。
实验中用到的主要耗材及试剂包括：乙腈、甲醇(LC-MS级，美国 Fisher 公司)；
甲酸、乙酸、甲酸铵(HPLC级，美国Fisher 公司)；
无水硫酸镁(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；
EMR净化小柱(500 mg/3 mL，美国Agilent公司)。
1.2 样品制备
待测样品由浙江省内水产养殖企业提供，品种为虾类、鳖类、鱼类、贝类和蟹类。其中，虾类样品去壳后取肌肉组织，鳖类样品取主体躯干部分去壳去内脏后取可食组织，鱼类样品带皮取肌肉组织，贝类样品沥干后去壳取可食组织，蟹类样品去背壳后取可食肌肉组织及性腺(蟹黄)部分，所有粗样均放入搅拌机中制为匀浆状，-20 ℃冻藏备用。
1.3 样品前处理
提取试剂及提取方法的选择：PCP的pka为4.9，呈弱酸性，因此可以根据实验需要选择酸性或者碱性溶剂进行提取。试剂为碱性环境时PCP为离子态，提取液可以直接兼容阳离子交换小柱进行上样，试剂为酸性环境时PCP为分子态，易被乙腈等有机试剂萃取。本研究参照王连珠等[14]的方法，选择1% 乙酸酸化乙腈作为提取溶液，之后进一步验证了不同体积(5 mL、10 mL、15 mL和20 mL)提取液在6种水产品基质(大口黑鲈(Micropterussalmoides)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、缢蛏(Sinonovaculaconstricta)、中华鳖(TrionyxSinensis)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)和青蟹(Scylla)，下同)中对PCP的单次提取效果(称样量为2.00 g)，以确定最优的提取条件。
EMR小柱上样溶液的选择：EMR小柱主要通过体积排阻和疏水作用吸附脂类等长链物质达到净化目的，这类通过吸附干扰物的通过式SPE净化方式相比“上样、淋洗、洗脱”三步法SPE净化方式更为便捷高效。EMR小柱通常采用乙腈/水溶液体系作为上样溶液[16]，且需要优化上样溶液有机相比例以获取最佳净化条件。本研究考察了6种水产品基质下，不同乙腈体积分数的上样溶液(50%乙腈溶液～95%乙腈溶液，以5%比例递增)经EMR小柱净化后对PCP绝对回收率的影响。
优化后提取方法：准确称取2.00 g样品(精确至0.01 g)置于50 mL带盖离心管中，分别加入100 μL 1 mg/L的五氯酚-13C6同位素内标工作液和1.0 g无水硫酸镁，混匀后加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液(v/v)，漩涡振荡提取5 min后再超声提取5 min，之后以8 000 r/min离心5 min，移取全部上清液于新的50 mL离心管中，再向样品离心管中加入10 mL 1%乙酸乙腈溶液(v/v)重复上述步骤提取一次，合并所有上清液于40 ℃下氮吹至近干(不能吹干)，加入2 mL的75%乙腈水(v/v)溶液复溶，待净化。
优化后净化方法：样品复溶液漩涡振荡1 min后全部移至5 mL Eppendorf离心管中，在4 ℃下14 000 r/min低温高速离心10 min，取全部上清液过EMR小柱净化。所有样品溶液过柱后再用0.5 mL 75%乙腈水(v/v)溶液润洗EMR小柱，收集所有流出液并过0.22 μm有机滤膜于进样小瓶，待上机。
1.4 LC-MS/MS条件
1.4.1 色谱条件
为对色谱方法的流动相进行优化，本研究考察了甲醇和乙腈流动相体系对于PCP色谱行为的影响，并筛选了不同品牌的C18色谱柱。优化后色谱条件为：色谱柱为ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；
流动相A为5 mmol/L甲酸铵，流动相B为甲醇；
柱温为40 ℃；
流速为0.3 mL/min；
进样量为2 μL。梯度洗脱程序：0～0.50 min，25%B；
0.50～4.00 min，25%～100%B；
4.00～6.00 min，100%B；
6.00～6.10 min，100%～25%B；
6.10～8.00 min，25%B。
1.4.2 质谱条件
离子源模式为ESI-，离子源温度550 ℃，电喷雾电压-4 500 V，雾化气(GS1)压力345 kPa，辅助气(GS2)压力379 kPa，气帘气(CUR)压力172 kPa，扫描方式为多反应监测(MRM)模式，具体质谱参数见表1。
1.5 数据分析和计算
所有平行实验均重复测定6次，数据以平均值表示。基质效应计算公式如下：基质效应(%)=[(基质匹配标准曲线斜率/纯溶剂标准曲线斜率)-1]×100%。绝对回收率计算公式如下：绝对回收率(%)=[(加标样品经净化处理后待测药物的峰面积/与加标样品同等浓度的纯试剂溶液待测药物峰面积)]×100%。
表1 目标化合物的质谱参数Tab.1 Mass spectrometric parameters for target compounds
2.1 质谱条件的确定
采用针泵注射，对13C6-PCP和PCP-Na进行一级质谱全扫描。结果表明13C6-PCP和PCP-Na在负源条件下响应较高，能够分别形成含有4个同位素峰的[M-H]-和[M-Na]-准分子离子峰簇，丰度比接近3∶5∶3∶1。
以PCP-Na为例，进一步对其4个同位素离子峰(m/z262.7、m/z264.7、m/z266.7和m/z268.7)进行二级质谱碎裂分析，发现上述离子的主要碎片离子均为[Cl]-，且存在m/z35.0和m/z37.0两个同位素峰(m/z262.7离子除外)，因此选择[M-Na]-> [Cl]-作为MRM模式的待优化离子对，并对所有7个离子对组合的碰撞能量进行了优化(见图1)。结果表明7个离子对的最优碰撞能量条件均为-50 eV，m/z264.7>35.0离子对的丰度是最高的，其次为m/z262.7>35.0 离子对，这与陈晓红等[17]的研究结果基本一致。因此本研究最终选择上述两个离子对分别作为定量和定性离子对，以两个不同母离子对应子离子的情况获得5个识别点满足欧盟2006/657/EC决议[18]对LC-MS/MS分析方法的定性要求。13C6-PCP质谱规律与PCP-Na基本一致，优化后的具体质谱参数见表1。
图1 碰撞能量对五氯酚离子对响应强度的影响Fig.1 The influence of collision energy on the intensity response of pentachlorophenol ion pair
2.2 色谱条件的优化
2.2.1 流动相的确定
试验结果表明，相比乙腈流动相体系，PCP在甲醇流动相体系中出峰时间更迟，质谱响应值更高。同时，在水相中加入缓冲盐(甲酸铵)可有效改善目标化合物的峰形，稳定出峰时间，防止峰漂移情况的出现。因此最终本研究采用甲醇作为有机相，5 mmol/L 甲酸铵为水相，反复试验后确认1.4.1节中所描述的梯度洗脱程序。
2.2.2 色谱柱的选择
PCP疏水性较强，大部分研究报道通常采用C18色谱柱作为分析柱[14-15]。不同品牌的C18色谱柱由于在硅胶纯度、键合和杂化技术等生产工艺存在区别，导致其保留性能和选择性存在不同进而影响目标物在质谱分析中的灵敏度。本研究发现不同品牌的C18色谱柱对PCP的保留能力具有差异性，且PCP出峰时间越迟其质谱响应越强。在研究组实验室现有条件下，ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱分析PCP时保留能力最强，具有最高的质谱响应，因此最终被选为色谱分析柱。
2.3 样品品种的选择
选择缢蛏、罗氏沼虾、大口黑鲈、中华鳖、大黄鱼和青蟹共6种基质作为检测对象。相比标准方法[19]，本研究新增贝类和龟鳖类样品基质并兼顾高脂和低脂鱼类，保证了方法在水产品中的广泛适用性。
2.4 前处理条件的优化
2.4.1 提取溶剂及提取方式的选择
采用1%乙酸酸化乙腈溶液作为PCP的提取试剂，相比碱化乙腈，提取后溶液更为清澈干净。生物样品中的PCP部分以结合态存在，因此本研究在用酸化乙腈溶液提取后，进一步采用超声辅助酸解，同时加入无水硫酸镁吸附水分，以增加乙腈的萃取效率。同时，乙腈良好的沉淀蛋白效果使得提取液中主要的干扰物质为脂类等弱极性化合物，有利于后续EMR小柱的针对性净化。
PCP的提取效率验证实验参照1.3节进行，结果(见表2)表明10 mL提取液即可在6种水产品基质中满足PCP 70%以上的提取效率，再增加提取液体积对平均提取效率增加不明显。之后，对提取试剂的提取次数进行了验证，实验结果表明重复提取2次和3次后平均提取率分别增加5%和7%，为了保证实际样品中结合态PCP的提取效率，本研究最终采用两次重复提取方式。
表2 不同体积提取液的提取效率验证结果Tab.2 The results of extraction efficiency by the extraction reagent with different volumes
2.4.2 EMR小柱上样溶液的确定
EMR小柱的上样溶液比例验证实验参照1.3节进行，结果表明(见图2)大黄鱼和大口黑鲈基质以80%乙腈溶液上样净化效果最好，绝对回收率平均值分别为77.1%和74.9%；
缢蛏、中华鳖、罗氏沼虾和青蟹基质使用75%乙腈溶液上样达到最优效果，绝对回收率平均值分别为68.2%、78.7%、79.1%和52.3%。考虑到青蟹和缢蛏的回收率整体偏低，同时大黄鱼和大口黑鲈基质在采用75%乙腈溶液上样后回收率仍有70%以上，本方法最终选择75%乙腈水溶液作为EMR小柱的上样溶液。
图2 6种水产品基质下不同比例乙腈上样溶液对五氯酚回收率的影响Fig.2 Effects of acetonitrile solution with different volume fraction on the recovery of pentachlorophenol in six kinds of aquatic products
2.5 基质效应
基质效应是质谱分析中影响检测准确度和灵敏度的重要因素[20]，本研究采用同位素内标法对基质效应进行校正，并对6种水产品基质的基质效应进行了考察。结果表明(见表3)除了青蟹表现为中等强度基质效应(20%≤|ME|≤50%)，其余基质均为弱基质效应(|ME|<20%)。青蟹样品由于含有大量蟹黄组织净化负担大，因此基质效应相对较强，但通过EMR小柱的净化和同位素内标法的校准，本方法定性和定量均具有良好的准确性和稳定性。
表3 6种基质中五氯酚的基质效应、回收率和相对标准偏差Tab.3 Matrix effects (ME), recoveries and relative standard deviations (RSDs) in six kinds of matrices n=6
2.6 方法学确证
采用同位素内标法配置校准溶液，以PCP的定量离子对峰面积与相应同位素内标峰面积的比值(y)为纵坐标，质量浓度(x，μg/L)为横坐标做6个浓度水平的内标定量工作曲线，该工作曲线的线性范围为0.5～100.0 μg/L，线性方程为y=0.009 14x+0.004 05，相关系数(r)为0.999 5。如表3所示，6种基质中PCP的加标回收率为89.6%～103.0%，相对标准偏差为4.39%～12.2%(见表3)。在0.5 μg/kg 水平标准添加时，上述6种基质中PCP的信噪比S/N最低为16，符合相关法规要求，最终确认本方法的定量限为0.5 μg/kg。
2.7 实际样品分析
采用本方法对15批次缢蛏、21批次罗氏沼虾、18批次大口黑鲈、40批次中华鳖、33批次大黄鱼和15批次青蟹进行分析，其中1批次中华鳖检出PCP残留(见图3)，含量为0.86 μg/kg，其余样品均未检出PCP。采用标准方法[19]及研究组之前依据标准优化过的实验方法[21]对该阳性样品进行检测，其检出值分别为0.76 μg/kg和0.91 μg/kg，可见本方法准确可靠。
图3 中华鳖阳性样品的MRM色谱图Fig.3 The extracted ion chromatography for positive samples of Trionyx sinensis under MRM mode
本研究建立了EMR小柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法快速测定水产品中痕量PCP及其钠盐的方法。相比标准方法，本方法采用EMR小柱的通过式固相萃取模式进行净化，进一步缩短了前处理时间。经验证，本方法测定结果准确、可靠，技术指标满足水产品中PCP-Na的残留分析及法规要求。
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