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李盛安何国成陈楠刘正华黎小鹏
(1.中山市食品药品检验所，广东 中山 528437；
2.中山市农产品质量安全检验所，广东 中山 528437；
3.中山市三乡镇农产品质量安全检测站，广东 中山 528463；
4.中山市小榄镇农业服务中心，广东 中山 528415)
大环内酯类抗生素(macrolide antibiotics，MALs)是一类重要的中谱抗菌化合物，养殖户将其作为治疗药物使用，广泛应用于畜禽、水产养殖业领域。MALs抗生素对于革兰氏阳性菌、支原体以及部分革兰氏阴性菌有良好的抑制和杀灭作用[1]；
由于缺少科学用药知识，抗生素及其代谢物将残留蓄积在动物组织和器官内，如果人们长期食用残留有MALs抗生素的畜禽或水产等，可造成前庭和耳蜗神经的损害，导致眩晕和听力减退，严重的会造成肝、肾损害[2]。水产养殖水体中残留的MALs抗生素不仅影响水生动物生长，还会随养殖尾水排放进入下游流域继续对下游水生动物及水环境产生影响。
目前，国内已有科研人员对动物源性食品开展MALs抗生素的残留检测研究工作，大量文献对畜禽中MALs抗生素探讨与研究，而对水产领域的研究相对较少。常见的水产中MALs抗生素检测方法有高效液相色谱法[3]和液相色谱串联质谱法。鱼肉含有蛋白质、脂肪等各种大分子营养成分，样品基质较为复杂。由于检测器的局限性可能会影响色谱峰的保留时间及峰型，MALs抗生素残留采用色谱法配合紫外检测器检测无法准确的定性定量。
早在20世纪80年代初，广东省中山市水产养殖户就成功培育出了脆肉鲩，经过40a有余的技术摸索及经验积累，已掌握一套成熟的养殖推广技术。目前，脆肉鲩在中山市养殖规模近2000hm2，产品销往国内近30个城市及港澳地区，脆肉鲩加工做成的美食深受人们喜爱。中山脆肉鲩现成为我国国家地理标志产品，每年为养殖户增收超过2亿元，脆肉鲩已成为中山市发展现代农业主要支柱产业之一。我国《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量规定》(GB 31650-2019)规定鱼(皮加肉)中红霉素(erythyomycin)残留限量为200μg·kg-1，而其它MALs抗生素林可霉素(lincomycin)、竹桃霉素(oleadomycin)、替米考星(tilmicosin)、泰乐菌素(tylosin)、克拉霉素(clindamycin)、螺旋霉素(spiramycin)、吉他霉素(kitasamysin)、交沙霉素(josamycin)并未作出明确规定。由于各种MALs抗生素的分子结构特征及药物性质相似，在预防治疗水产疾病有异曲同工的作用。可能存在不法养殖户使用大剂量的其它MALs抗生素而逃避监管。因此，在中山市开展脆肉鲩中多种MALs抗生素残留检测具有重要的意义。
1.1 试剂与仪器
乙腈、甲醇(色谱纯，色谱科公司)；
甲酸(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；
PRIME HLB固相萃取柱(3mL，60mg，沃特世公司)、0.2μm尼龙针式过滤器(天津市津腾实验设备有限公司)。
电子天平(Precisa公司)；
摇床，IKA KS 501(德国IKA集团公司)；
离心机Sigma 3-18KS(德国Sigma离心机有限公司)；
A10超纯水纯化系统(Millipore公司)；
超高效液相色谱-串联质谱仪UHPLC-MS/MS(1290-6495)(安捷伦科技有限公司)。
林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、克拉霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素混合标准品为天津阿尔塔科技有限公司。
1.2 色谱质谱条件
色谱柱：Poroshell 120 EC-C18(2.1mm×100mm,2.7μm)；
进样量：5μL；
柱温：40℃；
流动相：A为0.1%的甲酸水溶液，B为甲醇溶液，流速为0.4mL·min-1；
分离9种MALs抗生素的流动相梯度洗脱条件见表1。
表1 9种MALs抗生素的流动相洗脱梯度
电离方式：喷射流电喷雾电离AJSESI+；
干燥气温度：200℃；
干燥气流速：17L·min-1；
雾化器压力：40psi；
毛细管出口电压：380V；
鞘气温度：350℃；
鞘气流量：11L·min-1。监测模式：多反应监测(MRM)采集方式；
各抗生素组分离子对及碎裂电压、碰撞能量及保留时间见表2，9种MALs抗生素多反应监测(MRM)色谱图见图1。
1.3 定性与定量
定性，检测时在同样的条件下，样品溶液中色谱峰的保留时间应与混合标准溶液的保留时间一致，容许偏差在±5%以内，样品溶液中的离子丰度比应与浓度接近的标准溶液的一致，容许偏差符合GB 31660.1-2019要求。定量方法采用内标法定量。
表2 9种MALs抗生素测定的色谱质谱测定条件参数
1.4 样品提取和净化
脆肉鲩鱼肉搅碎后称取鱼肉样品10g于50mL具塞离心管中，加入适量替米考星D3内标工作液。加10mL乙腈水(v∶v/8∶2)，拧好盖子后放置摇床以300r·min-1震荡混匀20min，以4500r·min-1离心5min。将上清液转移直接过PRIME HLB 固相萃取柱(3cc，60mg)，无需润洗，以约1滴·s-1速度收集，弃去最开始的3～5滴滤液然后收集。准确吸取5.0mL滤液，在40℃水浴氮吹至近干，加入1mL甲醇加水(v∶v/1∶1)溶液溶解，过0.2μm滤膜，供液相色谱串联质谱联用仪分析测定。同时，做样品空白试验。
2.1 鱼肉前处理提取方法的选择
考虑到鱼肉中含有大量的蛋白质及脂肪等大分子，在提取MALs抗生素时干扰物质较多。实验对比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇、乙腈水(v∶v/8∶2)溶液4种提取液，分析上述4种提取液的加标回收率，乙腈水(v∶v/8∶2)溶液提取效果相对优于其他提取液。最终本文采用了乙腈水(v∶v/8∶2)溶液为提取液。
2.2 线性回归方程及检出限
使用基质配制标准溶液建立标准曲线对样品进行外标法定量，可以有效消除样品基质对抗生素组分的干扰。用不含MALs抗生素的鱼肉空白基质溶液稀释配制标准品，配制浓度分别为1.0μg·L-1、5.0μg·L-1、10.0μg·L-1、20.0μg·L-1、50.0μg·L-1、100.0μg·L-1的系列MALs基质混合标准溶液，加入适量内标工作液，上机待测。以各抗生素组分与替米考星D3内标定量离子色谱峰面积比为纵坐标，相应混标溶液与内标的浓度比为横坐标计算编制标准曲线，以各抗生素组分的特征离子色谱峰10倍信噪比(S/N>10)为方法定量限，线性回归方程、相关系数r2及各组分定量限见表3。9种MALs抗生素在1～100μg·L-1范围内线性回归方程呈良好的线性关系，相关系数r2均大于0.999，9种MALs抗生素的定量限为1.0μg·kg-1，能满足日常脆肉鲩水产品中9种MALs抗生素残留监测的需要。
图1 9种MALs抗生素特征离子质量色谱图
表3 9种MALs抗生素的线性回归方程、相关系数及检出限
2.3 方法回收率和精密度
称取不含MALs抗生素的鱼肉于50mL具塞离心管中，添加1ng·mg-1、2ng·mg-1、10ng·mg-1的9种MALs抗生素进行回收率实验，添加MALs抗生素混合标准溶液后拧紧盖子4℃放置过夜，每个浓度同时进行6个样品的平行实验。按照前处理方法分析测试。结果表明，9种MALs抗生素的加标回收率在79.8%～110%，相对标准偏差在4.53%～17.9%，方法具有较好的精密度和回收率。
2.4 实际样品的测定
采用本文建立的检测方法对中山市脆肉鲩养殖鱼塘中36个鱼肉样品(其中小榄镇26个、西区5个、港口镇5个)进行测定，9种MALs抗生素均未检出。
表4 鱼肉中9种MALs抗生素的平均加标回收率与精密度
本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定鱼肉中多种MALs抗生素残留的监测方法。该方法具有分析时间短、操作简单、定性准确高及检出限低等优点。标准《食品安全国家标准 水产品中大环内酯类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB 31660.1-2019)包括9种大环内酯类药物检测方法，但标准的分析时间较长。本文对前处理提取液进行优化，选择合适的色谱柱将9种MALs抗生素各组分分离，并优化了质谱测定条件，能在7min的检测时间内有效分离9种MALs抗生素，大大缩短了分析时间，提高了检测效率，能满足日常大批量监测的需要。
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