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陈红梅 张建欣 赵英仁
感染性疾病是具有明确病原体的一类疾病，病原体主要包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等4大类。临床工作中尽快明确病原是诊治感染性疾病的关键。但是传统病原学检测方法(包括涂片镜检、培养、抗原抗体的检查等)阳性率较低，导致病原学诊断十分困难。宏基因组高通量测序技术(mNGS)通过对临床样本DNA或RNA进行鸟枪法测序，可无偏倚检测多种病原微生物是目前病原学诊断的新技术，发展迅速，在肺部感染、中枢神系统感染、血流感染、胸腹腔感染[1-5]等感染性疾病中，对病原学诊断特别是结核分枝杆菌、布氏杆菌、杜氏利士曼原虫等少见病原体的诊断发挥了重要的作用[6-9]。但由于此项新技术尚未完全成熟，在应用过程中，我们也发现了一些问题，如序列数较低，难于判断污染、定值亦或是真正致病的病原微生物；
另外有些结果与传统培养结果不一致，导致临床医生决策两难。所以，在临床应用过程中，如何正确解读mNGS的检测结果，也是一项巨大的挑战。本文通过分析典型病例的诊疗过程，旨在探讨如何将mNGS更好地运用于临床，为临床医生提供更确切的诊断线索。
病例1，男，19岁，大一新生，因“发热伴全身皮肤黄染4天”于2020年9月19日入院。4天前患者无明显诱因出现发热，最高体温达38.2 ℃，无畏寒及寒战，同时发现全身皮肤黄染。我院门诊实验室检查：血常规：WBC计数 11.61×109/L(3.50～9.50×109/L，括号内为正常参考值，以下相同)，PLT计数 48×109/L(125～350×109/L)；
肝功能：总胆红素715.8 μmol/L(3.4～17.1 μmol/L)，直接胆红素627.9 μmol/L(0～3.4 μmol/L)，ALT 101 U/L(7～40 U/L)，AST 92 U/L(13～35 U/L)；
肾功能：尿素36.62 mmol/L(3.10～8.80 mmol/L),肌酐557 μmol/L(41～81 μmol/L)；
降钙素原6.47 ng/ml(0～0.50 ng/ml)；
凝血功能：凝血酶原时间14.2秒(9.8～12.1秒)，凝血酶原活动度81%(84%～128%)。胸、腹部CT未见明显异常。为进一步诊治，以“黄疸待查”收住院。患者居住于陕西省汉中市，1周前来西安上大学，入学后在校军训，无外出旅游及就餐史，既往体健，个人史及家族史无特殊。入院体格检查皮肤巩膜重度黄染，余无阳性体征。入院后查肝炎病毒系列(甲、乙、丙、戊肝)均为阴性，EB病毒(EBV)及巨细胞病毒(CMV)均为阴性。磁共振胰胆管成像(MRCP)检查未发现胆道梗阻因素。溶血指标无异常。患者有发热，WBC计数及降钙素原明显升高，影像学未发现明确感染灶，考虑严重血流感染导致脓毒症可能。但入院后行连续血培养结果均为阴性。为进一步明确病原，采外周血行mNGS检查，检测到钩端螺旋体特异序列，为进一步验证，行血清钩端螺旋体抗体检测结果为阳性，确诊为钩端螺旋体感染导致的急性肝肾功能损害。经进一步追问病史，患者入学前整理旧书时有鼠类排泄物接触史，推测为可能的感染途径。入院后经两次血浆置换及保肝退黄等对症治疗，并给予头孢曲松钠抗感染治疗后，患者体温恢复正常，肝功能及肾功能恢复正常后出院。
病例2，男，31岁，职员，因“发热伴咳嗽1周”于2021年2月18日入院。患者1周前劳累后出现发热，体温波动于37.5～39.8 ℃之间，伴咳嗽，咳少量白痰。当地医院查血常规提示WBC计数及中性粒细胞百分比升高，降钙素原轻度升高，胸部CT检查结果示胸膜肥厚粘连，胸腔积液、双下肺炎症。予以抗细菌、抗病毒等治疗后，体温仍反复波动。后转来我院，门诊以“肺部感染？”收住院。患者个人史无特殊，述其妻子2年前曾患输卵管结核,治疗3个月痊愈。入院体格检查：T 38 ℃，双下肺呼吸音粗，余无阳性体征。入院复查胸部CT提示右下肺新发斑片状影、两下肺纤维条索影。血常规：WBC计数 10.77×109/L，中性粒细胞百分比77.8%(40.0%～75.0%)。降钙素原正常。考虑为肺部感染，为明确病原，行痰细菌、真菌及结核菌涂片、培养检查，呼吸道病毒系列等病原学检测结果均为阴性。序贯应用“更昔洛韦”抗病毒、“莫西沙星、哌拉西林钠他唑巴坦钠”抗细菌治疗后，患者发热、咳嗽等症状无明显缓解。因结核菌素(PPD)试验阳性，且既往有结核患者密切接触史，考虑结核杆菌感染可能性大。进一步行支气管镜检查，采集肺泡灌洗液行mNGS检测，结果提示结核分枝杆菌复合群，特异序列数为9。诊断为肺结核。常规抗结核治疗后，患者体温逐渐降至正常，咳嗽症状缓解，经规律、足疗程治疗后，肺部炎症渗出消失。
病例3，男，48岁，货车司机，因“发热1月余”于2020年6月4日入院。患者1个月前无明显诱因出现发热，体温最高达37.8 ℃，轻度头痛，未重视，3周前体温升高至39 ℃，于当地医院查血常规提示WBC计数 17.78×109/L，中性粒细胞百分比92.2%，血培养4次结果均为阴性。当地医院拟诊“菌血症”，给予“莫西沙星、头孢哌酮钠舒巴坦钠”静脉滴注等治疗1周后体温恢复正常，3天后出院。1周前再次出现发热，体温最高达38 ℃，当地医院再次给予莫西沙星治疗体温无下降。3天前患者夜间突发寒战高热，体温达42 ℃，于我院就诊，门诊以“发热待查：中枢神经系统感染？”收入院。个人及家族史无特殊，开车运输路线固定，否认特殊病畜等接触史。入院后进一步行血培养、骨髓培养等病原学检查，结果均为阴性，胸部影像学及普通超声心动图检查无异常。因患者头痛，行脑脊液检查，结果提示压力正常，脑脊液常规生化无异常，脑脊液涂片及培养结果均为阴性，但脑脊液mNGS提示贝氏柯克斯体(Q热的病原体)阳性，1个特异序列。进一步检测特异抗体结果为阴性，给予多西环素治疗无效。后进一步经食道超声心动图检查发现主动脉瓣左冠瓣约1 cm大小赘生物，诊断为感染性心内膜炎，给予万古霉素抗感染治疗后，体温明显下降，后转至心外科手术治疗。
病例4，女，24岁，研究生在读，因“发热2周、全身皮疹12天”于2021年6月8日入院。患者2周前无明显诱因出现发热，体温最高达39.2 ℃，伴畏寒、肌肉酸痛、咽痛、双膝关节疼痛，12天前出现面部、四肢、腹部及背部散在红色皮疹，突出于皮面，无瘙痒及脱屑，于当地医院查铁蛋白>2 000 ng/ml(13～150 ng/ml)，肝功能异常。给予抗感染及对症治疗后效果不佳。为求进一步诊治遂来我院，门诊以“发热、皮疹待查”收入院。既往史、个人史、流行病学史无特殊。入院体格检查：T 38.8 ℃。右上臂可见散在红色丘疹，突出于皮肤表面，压之褪色。咽后壁红肿。余无阳性体征。入院后血常规检查：WBC计数 15.73×109/L，中性粒细胞百分比94.5%，PLT计数541×109/L，C反应蛋白64.1 mg/L(0～10.0 mg/L)，铁蛋白1 457 ng/ml(13～150 ng/ml)；
肝功能：ALT 100 U/L，白蛋白32.3 g/L(40.0～55.0 g/L)。胸、腹部CT检查结果提示双侧胸腔少量积液，盆腔积液，脾脏增大。正电子发射计算机断层显像(PET)-CT检查结果示全身多发稍大淋巴结，葡萄糖代谢不同程度增高，骨髓葡萄糖代谢弥漫增高，脾脏增大并葡萄糖代谢增高，考虑血液系统异常增殖性病变，建议行骨髓活检；
双侧少量胸腔积液。骨髓涂片及活检结果均无异常。行常规病原学检查结果均为阴性，血液mNGS结果阴性。肿瘤标志物及风湿免疫性疾病相关检查结果均为阴性。成人Still病属于排除性诊断，临床上需排除感染性疾病、风湿免疫性疾病及肿瘤性疾病。经全面检查排除上述3类疾病，依据敏感性及特异性均较高的日本标准[10],主要标准符合：(1)发热时体温大于39 ℃并持续1周以上；
(2)有关节痛持续2周以上；
(3)有典型的皮疹；
(4)WBC计数>10×109/L；
次要标准符合(1)咽痛；
(2)淋巴结肿大；
(3)脾脏肿大；
(4)肝功能异常；
(5)类风湿因子和抗核抗体阴性。本例患者符合包括4条主要标准的9条标准，明确诊断为成人Still病。给予糖皮质激素治疗后，发热及皮疹消退，肝功能恢复正常。
世界首例应用mNGS方法诊断了一例14岁男孩患的神秘脑炎，病原是钩端螺旋体，发表于2014年的新英格兰医学杂志，引起医疗界轰动[11]。后mNGS逐渐应用于感染性疾病的各个领域，显示其在发现新发病原体及罕见特殊病原体诊断方面的独特优势[12]。且mNGS不依赖于培养，报告时间较培养方法明显缩短，为临床决策争取了时间。为促进该技术的规范和发展，中华医学会组织检验及临床专家制定了2021版《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》(后简称2021版《共识》)[13]。
病例1以发热黄疸为主要表现，按照黄疸待查的诊疗思路，排除了梗阻性黄疸及溶血性黄疸，考虑肝细胞性黄疸。患者为青年男性，急性发热起病，既往无慢性肝肾病史，近期无酒精及药物应用史，迅速出现肝肾功能的严重损害，且WBC计数及降钙素原水平明显升高，临床考虑严重血流感染引起脓毒症的可能性大，但常规病原学检测结果均为阴性，通过血液mNGS检测发现钩端螺旋体阳性，进一步通过抗体检测阳性验证，同时追问到接触鼠类排泄物的流行病学史，进而经过目标病原治疗后，病情迅速好转，证实诊断明确。2021版《共识》临床适应证中共识3建议各种原因导致患者急危重症表现，不除外感染所致，建议常规检测的同时，或在常规检测基础上，开展mNGS。共识6建议高度疑似感染性疾病，但病原学诊断未明确且常规抗感染治疗无效，建议同时进行mNGS检测。此患者病情危重，考虑感染可能，通过mNGS迅速锁定目标病原，并通过其他方法确诊验证，结合流行病学史、临床表现及治疗效果综合分析、诊断明确。
病例2是一个有结核密切接触史的患者，出现发热、咳嗽等肺部炎症表现，常规抗感染治疗无效，且PPD阳性，高度怀疑结核感染，但常规结核菌检查结果为阴性。结核分枝杆菌为胞内寄生菌，且生长缓慢，生长条件苛刻，培养阳性率很低，mNGS在结核杆菌诊断方面表现出了特殊的优势。此例患者我们通过mNGS检测肺泡灌洗液显示结核杆菌复合群阳性，虽然只有9个特异性序列，依据2021版《共识》共识30，mNGS检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，呼吸道标本检出结核分枝杆菌，应认为是致病微生物。Zhou等[14]对123例怀疑结核感染患者同时进行mNGS及常规诊断结核的方法进行检测，显示联合mNGS和Xpert可明显提高结核杆菌及其他病原体的检出率。
病例3是一个发热待查的患者，发热待查的病因中仍以感染性疾病最常见，此患者前期抗感染治疗有效，且无风湿免疫性疾病及肿瘤性疾病的证据，仍考虑感染性疾病可能性大。我们采用mNGS在该患者脑脊液中检测到了极其罕见的Q热的病原体贝氏柯克斯体，但没有追踪到Q热相关的流行病学史及典型的临床表现，经有效药物治疗无效，且特异性抗体检测阴性，应考虑假阳性可能。进一步检查后发现心脏瓣膜的赘生物，诊断为感染性心内膜炎，经有效抗感染联合手术治疗，患者痊愈。mNGS十分敏感，可检测到微量的基因产物，但也不排除检测过程中的痕量污染。所以在临床诊治过程中，应该联合常规检测方法，结合流行病学史、临床表现及治疗反应综合判断，甄别假阳性可能。美国学者Graff等[15]收集了13个关于mNGS在儿童中枢神经系统感染疾病中的临床应用研究进行分析，结果提示mNGS结果必须依据患者的临床背景进行详细解读，mNGS的无偏倚性和高敏感性使其可检测到未被怀疑的病原体，而结合临床表现，这些病原体并不一定与临床相关。
病例4是一个青年女性，以发热皮疹为主要表现，临床符合成人Still病的诊断标准，但需要排除感染性疾病、风湿免疫性疾病及肿瘤性疾病。此例患者我们结合传统检测方法及mNGS，排除上述疾病。由于常规病原学检测方法的阳性率较低，即使阴性也不能完全排除感染，所以临床上往往需要广谱抗生素的足疗程治疗无效来排除感染，导致抗生素滥用、耐药菌及继发感染的发生。mNGS由于其高度敏感，对几乎所有病原微生物可无差别检测，所以其结果阴性对于排除感染常具有较高的阴性预测值[13]。Gan等[16]在一项关于mNGS在HIV阴性患者隐球菌性脑膜炎诊断的临床研究中发现，其阴性预测值达到98%。
正确的诊断源于科学的思维[17]。感染性疾病的病原学诊断采用传统的涂片、培养等方法阳性率较低，而mNGS等一些新兴技术发展迅速，敏感性明显提高，但对于检测结果，我们必须依据患者实际情况进行辩证分析，结合流行病学史、临床资料等综合评估，并通过有效的治疗进一步验证我们的判断是否正确。mNGS是传统病原学检测方法的有益补充，我们应该在临床应用中逐渐完善，并期望能更好地为临床服务。
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