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方海仙，耿慧春，普娅丽，王莉丽，李昕昀，刘宏程
（1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205；
2.农业农村部农产品质量监督检验测试中心（昆明），云南 昆明 650205；
3.元江县农产品质量安全检测站，云南 元江 653300；
4.云南经济管理学院，云南 昆明 650106）
洋葱[1-3]是百合科葱属2年生草本植物的鳞茎，是人们生活中必不可少的蔬菜，具有降血压、预防血栓形成、防癌抗癌、降低血糖、杀菌消炎、补充人体微量元素、预防感冒、治疗口腔溃疡等多种功效。同时，洋葱也是一类较为特殊的蔬菜，其中含有大量的烷基硫代半胱氨酸、亚砜类化合物等及其活性酶，在粉碎样品制成浆状后会产生大量含硫化合物[4-5]，在农药残留检测中会产生干扰，在日常检测中属于较难分析的样品。
洋葱在生长过程中，由于田间杂草影响其产量和品质，因此，会使用除草剂除草。除草剂能使杂草彻底或者选择发生枯死，被广泛地应用于各种草害的防治，但是，它在农业生长中长期大量使用，不可避免地造成了越来越多的残留。目前已研究报道较多的除草剂主要有酰胺类、三嗪类、磺酰脲类、二硝基苯胺类、苯脲类、二苯醚类、苯氧羧酸类和咪唑啉酮类[6]，其中，酰胺类除草剂是一类高效、高选择性的芽前除草剂，分为氯代酰胺类和酰芳胺类，主要用于防除1年生禾本科杂草与部分阔叶杂草，被应用于防治洋葱生长过程中的草害。氯代酰胺类除草剂能提高作物产量，同时也对环境和人体造成了严重危害，研究表明[7]，它们的代谢物能够引起人类淋巴细胞的姐妹染色单体的交换，乙草胺和丁草胺具有弱的基因毒性，乙草胺已被美国环保局定位B-2 类致癌物，因此，该类除草剂残留检测在限量范围内才能保证食用安全性。
葱蒜类蔬菜富含蒜氨酸类物质（即烷基硫代半胱氨酸和它的亚砜类化合物），该物质是最初且最重要的含硫化合物，是天然存在的内源性非蛋白氨基酸，不同的植物中蒜氨酸类物质的成分和含量不同，洋葱中主要是蒜氨酸、甲基蒜氨酸和丙基蒜氨酸。蒜氨酸酶又称蒜酶，它是一种糖蛋白，有二聚体、三聚体、四聚体等形式，不同的植物蛋白聚合形式是不同的，洋葱为四聚体[8]。在完整的细胞内，蒜氨酸酶和底物位于细胞的不同结构部位，蒜氨酸类物质以稳定、无臭的形式存在于细胞质中，能分解蒜氨酸类物质的蒜酶位于液泡中，液泡周围充满了细胞质，由于膜作为屏障，所以，二者无法接触。当细胞遭到破坏，如挤压、粉碎等作用时，蒜氨酸酶与底物相互接触发生反应生成丙酮酸、氨和包括蒜素在内的含硫化合物。在日常的残留检测中，蒜氨酸类物质本身不会干扰检测，但样品被粉碎时，其内含的活性酶与底物接触后产生大量的含硫化合物，该类物质与农药性质相近，易与农药一起提取出来，且含量远远高于农药残留的含量，在色谱和质谱测定中造成很强的背景干扰。目前，日常采用的一些国家标准和行业标准前处理方法，无法将这类物质去除。因此，建立一种能够有效消除硫化物干扰、准确性好的氯代酰胺类除草剂残留检测方法对洋葱质量控制具有重要的研究意义。
微波[9-10]是指波长在1～1 000 mm的电磁波，具有穿透、反射和吸收特性，用微波加热时食物会吸收微波而使自身发热。微波处理通过加热钝化酶的活性而作为一种钝酶技术[11-12]，其作用机理主要是基于微波的热效应和非热效应。热效应是指微波作用于物料，使物料表里同时吸收微波能，温度升高后使酶分子发生不可逆变性，导致失活，达到钝化酶的目的。非热效应[13-15]是指在微波电磁场的作用下物料中酶的空间结构被干扰和破坏，致使酶的分子结构中氢键松弛、断裂，使酶的亲和力降低，最终导致酶活力下降。如傅伟昌等[16]采用单因素试验及正交试验研究微波处理对松花粉脂肪酶灭活率，结果表明，当松花粉水分质量分数14%、微波功率324.3 W、微波时间2 min 时，脂肪酶灭活率为92.4%。因此，微波处理通过控制温度可用于钝化酶的活性，将含硫蔬菜硫化物截留在样品前处理阶段。
本研究根据含硫化合物产生的特点，采用微波处理钝化蒜酶的活性，避免含硫化合物的产生，在残留检测时能有效解决背景干扰问题，通过优化量化微波处理条件，得到最优的前处理条件，建立酰胺类除草剂残留分析检测方法，为洋葱的安全性监控和评价提供参考。
1.1 仪器与试剂
GC-7890B 气相色谱（配有7683 自动进样器、63Ni电子捕获检测器μECD，美国安捷伦公司）；
TDL-40B 低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；
HY-5A 振荡器（金坛市科析仪器有限公司）；
旋转蒸发仪（德国海道尔夫公司）；
电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；
水浴氮吹仪（美国Organomation N-EVAP 公司）；
涡旋振荡器（美国Thermo Scientific 公司）；
LG 微波炉（乐金电子（天津）电器有限公司，工作频率为2.45 GHz 的瓷控管微波炉）。
甲草胺GBW（E）081400、乙草胺GBW（E）061615、丙草胺GBW（E）081564、异丙甲草胺GBW（E）081402、丁草胺GBW（E）061412，以上标准品质量浓度均为1 000 μg/mL，购自农业农村部环境质量监督检验测试中心（天津）。
弗罗里矽（Florisil）固相萃取柱（1 g，6 mL，美国Supelco 公司）。正己烷（色谱纯，美国J.T.Baker 公司）；
丙酮（色谱纯，美国J.T.Baker公司）；
乙腈（分析纯）；
氯化钠（分析纯）。
1.2 试验方法
1.2.1 标准储备溶液的配制 分别移取乙草胺、甲草胺、异丙甲草胺、丁草胺、丙草胺1.0 mL用正己烷定容至25.0 mL，配制成单一标准储备液，贮存在-20 ℃冰箱中。准确吸取一定体积各单一标准储备液，用正己烷定容至25.0 mL，得到5 种氯代酰胺类的混合标准溶液，贮存在-4 ℃冰箱中备用。
1.2.2 样品微波处理
1.2.2.1 洋葱大小确定 洋葱一层层剥开，分别切成大小约为4、2、1 cm2的片，准确称取35.0 g试样至250 mL 三角瓶中，加入70.0 mL 乙腈，在匀浆机中以16 000 r/min匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有7～10 g 氯化钠的100 mL 具塞量筒中，收集滤液50～60 mL，盖上塞子，剧烈振荡1 min，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分层。
1.2.2.2 微波功率密度确定 洋葱一层层剥开，切成大小约1 cm2的片，准确称取35.0 g试样至250 mL三角瓶中，三角瓶口用铝箔纸封好待用。将上述装好样品的三角瓶置于微波工作站的加热腔内转盘中央，固定微波时间为20 s，分别在微波功率密度为0、2、6、10、14、20 W/g处理后，取出后待冷却至室温，再加入70.0 mL 乙腈，在匀浆机中16 000 r/min匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有7～10 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，收集滤液50～60 mL，盖上塞子，剧烈振荡1 min，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分层。
1.2.2.3 微波时间密度确定 洋葱一层层剥开，切成大小约1 cm2的片，准确称取35.0 g 试样至250 mL 三角瓶中，三角瓶口用铝箔纸封好待用。将上述装好样品的三角瓶置于微波工作站的加热腔内转盘中央，固定微波功率为14 W/g，微波时间密度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 s/g 处理后，取出后待冷却至室温，再加入70.0 mL乙腈，在匀浆机中16 000 r/min匀浆2 min后用滤纸过滤，滤液收集到装有7～10 g 氯化钠的100 mL 具塞量筒中，收集滤液50～60 mL，盖上塞子，剧烈振荡1 min，在室温下静置30 min，使乙腈相和水相分层。
1.2.3 样品的净化 从具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈溶液，放入150 mL浓缩瓶中，将浓缩瓶用旋转蒸发仪浓缩至近干，加入2.0 mL正己烷，盖上铝箔，待净化。
将弗罗里矽柱依次用5.0 mL 丙酮＋正己烷（10∶90（V/V））、5.0 mL 正己烷预淋洗，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入上述待净化溶液，用150 mL 浓缩瓶接收洗脱液，用5 mL 丙酮＋正己烷（10∶90（V/V））冲洗烧杯后淋洗弗罗里矽柱，并重复一次。将盛有淋洗液的浓缩瓶在旋转蒸发仪上（水浴温度＜40 ℃）浓缩至近干，用正己烷定容至5.0 mL，在漩涡混合器上混匀，分别移入2 个2 mL自动进样器样品中，供色谱测定。
1.2.4 气相色谱条件优化 色谱柱为DB-17 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；
载气为高纯氮气（99.999%），恒流模式，柱流速为1.0 mL/min；
进样量为1.00 μL，不分流进样，进样口温度为200 ℃；
尾吹气流量为60.0 mL/min；
微电子捕获检测器（μECD）温度为320 ℃；
柱温升温程序：初始温度150 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 升至270 ℃，保持15 min。
1.2.5 工作曲线绘制 分别移取适量的5 种氯代酰胺类混合标准储备液，用正己烷稀释得到一系列工作使用溶液。按照1.2.4 的条件进行分析，采用外标法定量，以标准溶液的峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标绘制工作曲线。
1.2.6 添加回收试验 分别称取不含5 种氯代酰胺类除草剂残留的洋葱样品10 份，每份35.0 g，其中1 份为对照，另外9 份样品分为3 组，每组3 份。第1组每份均加入混合标准溶液0.10 mL，使样品质量分数为0.01 mg/kg；
第2 组添加混合标准溶液0.5 mL，样品质量分数为0.05 mg/kg；
第3 组添加混合标准溶液2.5 mL 使样品质量分数为0.25 mg/kg，分别将上述样品充分混匀，放置1 h 后按照1.2.2、1.2.3、1.2.4 进行样品前处理和分析测定，每个添加浓度重复测定3 次，计算平均回收率和相对标准偏差。
1.2.7 实际样品测定 在开始对样品进行GCECD 测试之前，先测定标准工作液，直至相应组分色谱响应值稳定后开始进标样，制作校正曲线，之后进行样品测定。
随机测试送检的10批次样品，分别按照1.2.2、1.2.3和1.2.4进行前处理和分析测定。
1.3 基质效应
基质指的是样品中除分析物以外的组分，常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。基质效应按照以下公式[17]进行计算。
当ME为正值时，为基质增强效应，当ME为负值时，为基质减弱效应。基质效应在-20%～20%为弱基质效应，在-50%～-20%和20%～50%为中等基质效应，超过-50%或50%为强基质效应。
2.1 微波处理时样品状态的选择
试验过程中发现样品的状态对微波处理效果有较大影响。试验表明，样品不灭活处理，背景干扰相当强，无法进行残留测定；
粉碎后的样品经微波灭活后，消除基质干扰的作用不明显，对残留测定仍有较大影响。因此，本试验将洋葱一层层剥开后切成大小约为4、2、1 cm2的片，经1.2.2.1 和1.2.3处理后，采用1.2.4气相色谱条件上机测定，结果如图1所示。
从图1 可以看出，当洋葱大小为4 cm2时，杂质干扰最少，但存在匀浆时较难将其匀浆细的问题，当洋葱大小为2、1 cm2时，干扰相对较大，但没有明显差别，体积小时匀浆时容易将其匀浆细。综合考虑，洋葱大小确定为1 cm2。
2.2 微波功率密度的确定
从图2 可以看出，当微波功率密度≤10 W/g时，与未微波处理比较，杂质干扰更大，可能原因是这个微波功率密度下，酶的活力更强，加速了酶促反应；
当微波功率密度≥14 W/g 时，微波处理对杂质干扰具有明显的效果，微波功率密度太大，样品易于失水而烤糊，基于此，本试验选用微波功率密度为14 W/g。
2.3 微波时间密度的确定
由图3 可知，当微波时间密度≤0.5 s/g 时，跟未微波处理比较，杂质去除效果不明显，当微波时间密度≥0.7 s/g 时，微波处理对杂质干扰具有明显的效果，微波时间密度大，样品易于失水而不易提取，基于此，本试验选用微波时间密度为0.7 s/g。
2.4 微波处理后的色谱分析
在1.2.4条件下，洋葱不同处理的色谱及5种氯代酰胺类除草剂色谱分析如图4、5所示。
从图4—5 可以看出，未经微波处理洋葱杂峰很多，峰很高，几乎无法测定低浓度农药残留；
而微波处理后的洋葱，杂峰明显减少，峰很小，有效地消除了其基质中硫化物对待测物的干扰，表明微波处理可有效减少硫化物的干扰。
2.5 色谱条件的优化
为了得到5 种氯代酰胺类除草剂的最佳峰型和分离效果，本试验从不同程序升温、进样口温度、流量、检测器温度、不同色谱柱等方面对仪器的检测条件进行优化，比较了5 种农药在DB-1 和DB-17这2根不同极性色谱柱上的响应，其色谱结果如图6所示。
从图6可以看出，相同浓度的氯代酰胺类除草剂在色谱柱DB-17 上的响应比较大，灵敏度高，而在色谱柱DB-1 上的响应较差，因此，本试验选用DB-17色谱柱。
2.6 方法学验证
2.6.1 标准曲线、检出限、定量限 配制质量浓度为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的5种氯代酰胺类除草剂混合标准溶液，以峰面积（Y）对其质量浓度（X）绘制标准曲线，得到线性方程和相关系数（r）。
从表1可以看出，在线性范围内，5种氯代酰胺类除草剂的线性范围为0.01～1.00 μg/mL，相关系数≥0.999，线性关系良好，异丙甲草胺表现为弱基质效应，乙草胺、丁草胺和丙草胺为中等基质效应，甲草胺为强基质效应。因此，准确定量时，需要配制基质标准曲线进行定量计算。
表1 5种氯代酰胺类除草剂的线性方程、相关系数、线性范围、基质效应Tab.1 Linear equations，correlation coefficients（r）and matrix effect of the five amide herbicides
2.6.2 准确度和精密度 对空白洋葱样品添加不同水平的混合标准溶液，按照1.2.6 进行回收率和精密度试验，每个添加水平做3 个平行样品，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），以信噪比（S/N）≥3 确定检出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10 确定定量限（LOQ）。
从表2 可以看出，5 种氯代酰胺类除草剂的平均回收率为85.7%～109.0%，RSD 为0.206%～4.710%，说明该方法回收率高，稳定性好，能达到残留分析的要求。
表2 5种酰胺类除草剂的回收率、精密度、检出限、定量限Tab.2 Limits of detection（LODs，S/N=3），limits of quantification（LOQs，S/N=10），recoveries and precisions of the five amide herbicides
在日常的残留检测中，洋葱所含蒜氨酸类物质本身不会干扰检测，但样品被粉碎时，其内含的活性酶与底物接触后产生大量的含硫化合物，该类物质与农药性质相近，易与农药一起提取出来，且含量远远高于农药残留的含量，在色谱和质谱测定中造成很强的背景干扰，通过一般的净化方法很难将其除去。基于此，本试验根据洋葱含硫化合物产生的特点，在样品未被完全破坏时，采用微波处理钝化蒜酶的活性，切断蒜酶催化蒜氨酸类物质转化过程，避免含硫化合物的产生，从而将含硫化合物等基质干扰截留在样品前处理阶段，有效解决残留测定时背景干扰问题。通过微波功率密度和微波时间密度2 个因素衡量微波处理对洋葱杂质去除效果，降低背景干扰对检测的影响，建立了微波处理-气相色谱法测定洋葱中5 种氯代酰胺类除草剂残留的分析方法。在优化的色谱条件下，5 种氯代酰胺类除草剂色谱分离度好，峰型好，加标回收率结果满意，精密度、重现性满足农药残留要求，可满足日常检测。
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