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李志伟 任然悦 李孟伟 刘起昆 于小钧 蒋咏桥 鲍远 康皓
异三聚体G 蛋白是一种重要的细胞信号转导器，主要传递来自G 蛋白偶联受体的信号，使胞外信号穿膜转换为胞内信号，其有三个亚基：α、β和γ［1］。其中，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α13（Gα13）属于G 蛋白超家族的G12 亚家族，广泛表达于哺乳动物多种细胞中［2］。已有研究报道，Gα13是一种破骨细胞形成的负调控因子，其通过抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路，抑制破骨细胞形成［3］。
骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量低，骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病［4］。我国60 岁以上人口已超过2.1亿（约占总人口的15.5%），65岁以上人口近1.4亿（约占总人口的10.1%）［5］。而且骨质疏松症及骨折的医疗和护理，需要投入大量的人力、物力和财力，因此骨质疏松症给家庭和社会造成了沉重的经济负担。
中药淫羊藿常用于治疗骨质疏松症，其主要成分淫羊藿苷可通过抑制破骨细胞的形成来抑制骨质疏松症［6-7］。淫羊藿苷调节破骨细胞形成的正调节信号通路已有报道［8-10］，但通过调节负调节通路与负调控因子来抑制破骨细胞生成的研究较少。因此，本研究利用核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stlimulating factor，M-CSF）体外诱导小鼠骨髓单核细胞（bone marrow derived macrophages，BMMs）分化成破骨细胞的模型，探讨Gα13及Akt-GSK3β-NFATc1信号通路是否参与淫羊藿苷对破骨细胞的调控，从而研究淫羊藿苷对破骨细胞分化调节的作用机制，为临床治疗骨质疏松症提供新的思路和依据。
一、实验材料与仪器
淫羊藿苷（美国MCE公司），M-CSF（美国Pepro-Tech 公司），RANKL（美国R&D 公司），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒（美国Sigma 公司），鬼笔环肽、DAPI染色液、SYBR qPCR Mix（上海翊圣公司），总RNA 提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek 公司），PCR 引物由武汉擎科生物公司合成，C57/BL6小鼠购于鼠来宝（武汉）生物科技有限公司。恒温CO2细胞培养箱（香港Heal Force 公司），光学、荧光显微镜（日本Nikon公司），凝胶电泳仪、凝胶成像分析系统、实时定量PCR仪（美国Bio-BAD公司）。
二、骨髓单核细胞的分离提取
用含有M-CSF（30 ng/mL）的α-MEM培养基冲出C57/BL6 小鼠（6 到8 周龄）胫骨和股骨骨髓腔中的骨髓单核细胞（BMMs），在培养基中培养。24 h后收集瓶底未黏附的细胞继续培养，作为纯化的BMMs使用［11］。
三、TRAP染色鉴别破骨细胞
BMMs细胞接种于96孔板（2×104个/孔），24 h后加入100 ng/mL的RANKL，诱导其向破骨细胞分化，同时加入不同浓度（0、1、10 μmol/L）的淫羊藿苷，设一不加RANKL空白对照组，每组设3复孔。总共诱导干预5～7 d［12］。应用TRAP 染色试剂盒对诱导至终点的细胞进行染色，计算各组破骨细胞数目（破骨细胞为具有三个或更多细胞核融合而成的TRAP阳性细胞，光学显微镜下每组随机选取5个视野）。
四、鬼笔环肽染色检测细胞骨架F-actin 环形成分析
BMMs 细胞接种于96 孔板（2×104个/孔），分组及RANKL 诱导和淫羊藿苷干预同上。加入免疫染色固定液，室温固定10 min，用免疫染色洗涤液洗涤3次后，用鬼笔环肽室温避光染色30 min，加入DAPI染色液复染30 s，荧光显微镜下观察，拍照［13］。
五、破骨细胞相关标志物基因表达水平的分析
BMMs 细胞接种于6 孔板（50×104个/孔），实验分组同上，RANKL 诱导和淫羊藿苷干预3～5 d 后，提取RNA，逆转录，并行实时定量PCR 检测Rank、Cathepsin K、NFATc1、Gα13（表1）。
表1 qPCR的引物序列
六、破骨细胞相关标志蛋白表达水平的分析
BMMs 细胞接种于6 孔板（50×104个/孔），实验分组同上，RANKL 诱导和淫羊藿苷干预5 d 后，裂解细胞，提取全蛋白，各组蛋白等量上样后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，275 mA 恒流转膜90 min，5%脱脂牛奶室温封闭90 min，4 ℃孵育一抗，过夜，室温孵育二抗1 h，TBST 漂洗条带后在曝光机上显影。检测Gα13 蛋白、破骨细胞特异标志蛋白TRAF6 及 相关信号通 路 蛋 白AKT、NFATc1 的 表达。GADPH作内参。
七、统计学分析
应用SPSS 22.0（IBM 公司，美国）统计分析实验数据。计量数据以均数±标准差（）表示，多样本比较采用单因素方差分析检验，两样本比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
一、淫羊藿苷抑制破骨细胞的生成
TRAP 染色结果显示，与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L组相比，给予不同浓度的淫羊藿苷干预后，破骨细胞数目明显减少，且成浓度赖性，差异具有统计学意义（图1，P＜0.05）。
图1 淫羊藿苷干预后TRAP染色结果 a：对照组；
b：0 μmol/L组；
c：1 μmol/L组；
d：10 μmol/L组；
e：TRAP阳性细胞数目统计图（与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L组比较，*P＜0.05）
鬼笔环肽和DAPI染色同样显示，与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L 组相比，淫羊藿苷干预组显著抑制F-actin 环形成，且呈浓度依赖性，差异具有统计学意义（图2，P＜0.05）。上述结果表明淫羊藿苷可显著抑制破骨细胞形成。
图2 淫羊藿苷显著抑制破骨细胞F-actin环数目 a：鬼笔环肽和DAPI染色结果；
b：破骨细胞F-actin环形成数目（与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L组比较，*P＜0.05）
二、淫羊藿苷促进Gα13 基因的表达，抑制相关通路基因的表达
实时定量PCR检测结果表明，与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L 组相比，淫羊藿苷干预的各组中Gα13 基因的表达上调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L组相比，淫羊藿苷干预组中有Akt-GSK3β-NFATc1信号通路的NFATc1 基因和破骨细胞特异性基因Rank、Cathepsin K 的表达显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。
图3 淫羊藿苷促进Gα13基因的表达，抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1相关通路基因的表达（与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L 组比较，*P＜0.05）
三、淫羊藿苷促进Gα13 蛋白的表达，抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路相关蛋白的表达
Western Blot检测相关蛋白表达情况显示，与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L 组相比，淫羊藿苷干预组的Gα13 蛋白表达量显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。淫羊藿苷抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路相关蛋白Akt、NFATc1及破骨细胞特异标志蛋白TRAF6 的表达，差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。
图4 淫羊藿苷促进Gα13蛋白的表达，抑制Akt-GSK3β-NFATc1信号通路相关蛋白的表达 a：淫羊藿苷干预后各蛋白条带；
b：淫羊藿苷干预后各蛋白相对表达量（与未加淫羊藿苷干预的0 μmol/L组比较，*P＜0.05）
原发性骨质疏松症是一种以骨质量、骨强度和骨微结构系统性损坏为特征的代谢性疾病，给社会经济和公共卫生造成了严重威胁［14］。一些研究表明，骨质疏松症是由过度异常的破骨细胞活动引起的病理性骨吸收［15-17］。骨吸收增加表明破骨细胞在骨质疏松的发生、发展中起着关键作用，因此，抑制破骨细胞的异常形成和激活可能是治疗骨质疏松症有效的策略之一［18］。
中药淫羊藿常用于治疗骨质疏松症，淫羊藿苷是淫羊藿中含量最丰富的类黄酮成分，对骨质疏松症、骨折愈合和关节疾病均有疗效［19］。研究报道，淫羊藿苷有多种生物活性，包括促进成骨细胞增殖、抑制破骨细胞形成、防止骨丢失［20］。淫羊藿苷通过调节许多破骨细胞形成的正调节信号通路已经被报道，如淫羊藿苷通过调节NF-κB 和MAPK 等通路来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成［10，21］，但通过调节负调节通路与负调节因子来抑制破骨细胞生成的研究较少。
Gα13属于G蛋白超家族的G12亚家族，是一种内源性破骨细胞的负调控因子，可通过调节Rho-GEF-RhoGTPase 信号通路来调节细胞骨架组织、线粒体功能，还可通过调节RhoA 因子的活化、Akt-GSK3β-NFATc1信号通路等多种途径抑制破骨细胞形成［22-23］。本研究结果显示，不同浓度淫羊藿苷干预后，破骨细胞数目明显减少，破骨细胞相关基因RANK 和相关蛋白TRAF6 表达量明显降低，表明淫羊藿苷可明显抑制破骨细胞生成，抑制作用与淫羊藿苷浓度正相关。淫羊藿苷处理后，Gα13基因及蛋白表达量明显上调，其下游Akt-GSK3β-NFATc1 信号通路中Akt、NFATc1基因及蛋白量显著下降。上述结果表明Gα13可能参与了调控淫羊藿苷抑制破骨细胞形成的相关通路。
综上所述，Gα13可能参与了调控淫羊藿苷抑制破骨细胞形成的相关通路，淫羊藿苷可能通过促进负调控因子Gα13的表达，从而抑制其下游Akt-GSK3β-NFATc1信号通路来抑制破骨细胞形成。本研究就淫羊藿苷对破骨细胞分化调节的作用机制进行探讨，为临床治疗骨质疏松症提供了新的思路和参考。
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