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秦小菀，高伟霞，陈朴
肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是一种急性呼吸道感染性疾病，近年来，MPP 发病率逐年升高，而肺炎支原体是引起肺部感染的重要原因［1-2］。MPP 发病机制尚未完全阐明，既往研究显示微小RNA（microRNA，miRNA）等非编码RNA 在MPP 发病过程中发挥重要作用［3］。长链非编码RNA H19（LncRNA H19）在急性胰腺炎病人血清中表达水平升高，并可能作为有效诊断指标［4］。研究表明LncRNA H19 在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的内皮细胞中呈高表达并可能参与内皮细胞损伤过程［5］。但LncRNA H19 在MPP 病儿中的表达及其临床意义尚未阐明。因此，本研究首先检测MPP 病儿血清中LncRNA H19 的表达水平，分析其对MPP 的诊断价值，其次通过体外培养小鼠肺泡巨噬细胞MH-S，探讨LncRNA H19 表达状态对MH-S 细胞凋亡及炎性因子表达的影响及其可能作用机制。
1.1 一般资料收集2017 年10 月至2018 年12 月南阳市中心医院收治的MPP病儿60例为观察组，所有病儿均符合MPP诊断标准［6］。经实验室检查确诊为MPP，其中男30例，女30例，年龄范围1～10岁，年龄（5.62±2.32）岁。根据病儿病情程度分为恢复期（30 例）与急性期（30 例）。MPP 病儿近期均未服用糖皮质激素药物；
未服用免疫抑制剂药物；
未合并免疫系统疾病；
未合并其他感染性疾病；
未合并支气管哮喘等疾病。选取同期到我院体检的健康儿童60 例作为对照组，其中男40 例，女20 例，年龄范围1～10岁，年龄（5.58±3.11）岁。两组研究者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 小鼠肺泡巨噬细胞MH-S 购自上海雅吉生物科技有限公司；
DMEM、胎牛血清购自美国Gibco 公司；
Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司；
LncRNA H19小干扰RNA（si-H19）、乱序无意义阴性序列（si-NC）购自上海吉玛制药有限公司；
兔抗鼠GAPDH 抗体购自美国CST 公司；
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；
ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
1.2.2 采集样本 采集各组受试者空腹静脉血5 mL，吸取上清，置于-20 ℃保存备用。
1.2.3 qRT-PCR 检测LncRNA H19 的表达水平采用Trizol 法提取总RNA，参照反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，反应条件：95 ℃、60 s，95 ℃、60 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 次循环。采用2-ΔΔCt法计算LncRNA H19 相对表达量。
1.2.4 细胞处理与实验分组 参考相关文献提取肺炎支原体脂质相关膜蛋白（LAMPS），置于-80 ℃超低温冰箱内保存［7］。取出冻存MH-S细胞，在含有10%胎牛血清的DMEM 培养基培养，待细胞生长至80%融合时，进行传代培养。取对数期MH-S 细胞，使用2 μg/mL的LAMPS处理24 h［8］，记作LAMPS组。同时将未经处理的细胞作为对照组。根据Lipofectamine 2000试剂盒说明书分别将si-NC、si-H19转染至MH-S 细胞，使用2 μg/mL 的LAMPS 处理24 h，分别记作si-NC组、si-H19组。
1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组MH-S 细胞，加入500 μL Binding Buffer 悬浮细胞，依次加入5 μL Annexin V-FITC 与5 μL PI，充分混匀，室温避光孵育10 min，置于流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.2.6 ELISA 法检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）水平收集各组细胞培养上清液，采用ELISA 法检测炎性因子水平。
1.2.7 蛋白质印迹法（Western blotting）检测B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bax）、细胞色素C（Cyt C）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）蛋白表达 收集各组MH-S 细胞，根据BCA 试剂盒检测蛋白浓度。行SDS-PAGE 电泳，将分离的蛋白转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗稀释液（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入二抗稀释液（1∶2 000），室温孵育1 h，暗室内曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。
1.3 统计学方法采用SPSS 21.0 进行分析，计量资料以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；
计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组血清LncRNA H19 表达比较与对照组相比，观察组病人血清LncRNA H19 的表达水平显著升高（1.01±0.13）比（2.58±0.25）（P＜0.05）；
与MPP恢复期病人相比，MPP 急性期病人血清LncRNA H19的表达水平显著升高（1.63±0.20）比（3.24±0.39）（F=739.16，P＜0.05）。
2.2 LncRNA H19 对MPP 的诊断价值ROC 分析LncRNA H19 对MPP 的诊断价值，结果显示LncRNA H19 在MPP 诊断中敏感度为86.67%，特异度为86.67%，AUC 面积为0.869，95%CI：0.795～0.924，截断值为1.36，见图1。
图1 LncRNA H19对肺炎支原体肺炎的ROC分析图
2.3 LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞中LncRNA H19的表达量与对照组相比，LAMPS 组细胞中LncRNA H19的表达水平显著升 高（1.02±0.16）比（2.57±0.24）（t=16.12，P＜0.05）。
2.4 沉默LncRNA H19 对LAMPS 诱导的肺泡巨噬细胞凋亡的影响与对照组相比，LAMPS 组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；
与si-NC 组相比，si-H19 组细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3 蛋白水平显著降低（P＜0.05），见图2、表1。
表1 沉默LncRNA H19对LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞凋亡的影响/
表1 沉默LncRNA H19对LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞凋亡的影响/
注：LAMPS 为肺炎支原体脂质相关膜蛋白，si-NC 为乱序无意义阴性序列，si-H19为LncRNA H19小干扰RNA，Bax为B淋巴细胞瘤-2相关蛋白，Cyt C 为细胞色素C；
Cleaved Caspase-3为活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。①与对照组相比，P＜0.05。②与si-NC组相比，P＜0.05。
图2 肺泡巨噬细胞凋亡：A为流式细胞术检测细胞凋亡；
B为细胞凋亡相关蛋白免疫印迹图
2.5 沉默LncRNA H19 对LAMPS 诱导的肺泡巨噬细胞炎性因子的影响与对照组相比，LAMPS 组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著升高（P＜0.05）；
与si-NC组相比，si-H19 组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平显著降低（P＜0.05），见表2。
表2 沉默LncRNA H19对LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞炎性因子的影响/（pg/mL，）
表2 沉默LncRNA H19对LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞炎性因子的影响/（pg/mL，）
注：LAMPS 为肺炎支原体脂质相关膜蛋白，si-NC 为乱序无意义阴性序列，si-H19 为LncRNA H19 小干扰RNA，TNF-α 为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白细胞介素-1β，IL-6为白细胞介素6。①与对照组相比，P＜0.05。②与si-NC组相比，P＜0.05。
肺泡巨噬细胞可维持肺部正常环境，并可抑制炎症反应及清除肺组织内细胞碎片等，研究表明LAMPS 可通过与巨噬细胞表面部分受体结合从而激活相关炎性信号通路从而释放炎性因子［9-10］。巨噬细胞异常凋亡也可促进炎症递质的释放从而促进MPP进展［11-12］。但肺泡巨噬细胞损伤的分子机制尚未阐明。
沉默LncRNA H19 通过上调miR-130b 而抑制经ox-LDL 诱导的炎症反应［13］。研究表明LncRNA H19可增强幽门螺杆菌感染诱导的炎症反应从而促进胃癌细胞的生长［14］。相关报道指出LncRNA H19通过发挥本身的作用可增加血管炎性水平［15］。这个报道与本研究结果类似。本研究结果显示MPP病儿血清中LncRNA H19 的表达水平显著升高，急性期病儿血清LncRNA H19 的表达水平高于恢复期，提示LncRNA H19 表达量升高可能促进MPP 的发生及发展。本研究通过ROC分析LncRNA H19对MPP 的诊断价值，结果显示LncRNA H19 在诊断MPP 时的灵敏度与特异度较高，提示LncRNA H19对MPP 具有一定诊断价值。综合上述实验结果证实LncRNA H19可能作为临床诊断MPP的分子标志物，还可能用于判断疾病进展。同时本研究采用LAMPS 处理肺泡巨噬细胞建立细胞损伤模型，结果显示细胞中LncRNA H19 的表达水平显著升高，进一步分析显示LAMPS 处理后肺泡巨噬细胞的凋亡率明显升高，而沉默LncRNA H19 表达后细胞凋亡率显著降低，提示沉默LncRNA H19表达可明显抑制LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞凋亡［16］。本研究结果显示，沉默LncRNA H19 表达可抑制LAMPS 诱导的肺泡巨噬细胞凋亡。炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高可参与多种疾病发生过程，研究表明TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高可破坏肺泡上皮细胞及血管内皮细胞［17-19］。本研究结果显示LAMPS 处理肺泡巨噬细胞后，炎性因子明显上调，而沉默LncRNA H19 表达可明显下调炎性因子水平，提示沉默LncRNA H19表达可抑制LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。
综上所述，LncRNA H19 在MPP 病儿血清中呈高表达，并可作为诊断与评估MPP 病情的分子标志物，体外细胞实验中，沉默LncRNA H19 表达可明显降低LAMPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应，抑制细胞凋亡，可为临床预防及治疗MPP 提供新思路。但LncRNA H19 在MPP 发生发展过程中的调控机制仍需进一步探讨。
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