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郭海兵，曹海涛，耿建新，王科文
[硕腾（上海）企业管理有限公司，上海 长宁 200050]
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的传染性疾病，俗称“蓝耳病”，1987年在美国暴发后至今，已经成为危害世界养猪业最重要的疾病之一。我国作为世界上最大的养猪和猪肉生产国，受PRRS的影响尤为严重。虽然，养猪生产者、兽医和相关科学家经过多年与该病斗争，通过各种途径控制和净化该病取得了很大进展，但仍未能得到理想控制。疫苗免疫是防控PRRSV的重要措施，但是一直以来饱受争议。灭活苗在临床上更安全，且不会发生散毒和毒力返强，更便于储存和运输，但是其临床保护效率较低、需要多次注射以及副反应大等因素，不能有效控制PRRSV的发生和流行（Zuckermann等，2007）[1]。减毒活疫苗（PRRSV MLV）具有更好的免疫效果，在全球得到广泛应用。但是，PRRSV MLV对于同源毒株的保护效果较好，对异源毒株提供的交叉保护性较差（Zhao等，2015）[2]。近年来由于PRRSV基因高度变异和重组演化的特性，使得猪场PRRSV毒株越来越多样化，PRRSV MLV防控效果不理想，国内猪场又开始尝试PRRS灭活疫苗免疫。本文主要根据灭活疫苗的免疫机理、效力评价指标以及文献报道的数据来探讨PRRS灭活疫苗免疫的效力，希望为猪场科学选择和使用PRRS疫苗提供有力依据。
目前评价PRRS疫苗效力主要依靠免疫攻毒保护试验，辅助的评价试验包括抗体和细胞因子评价试验（吴佳俊等，2010）[3]。中和抗体曾被认为是评价PRRS疫苗免疫效果的重要指标，但是这方面的报道存在不同的结论和观点，有学者报道它能保护猪抵御PRRSV的攻击，也有学者对中和抗体的作用提出质疑（吴佳俊等，2010）[3]。Zuckermann等（2007）[1]的试验结果表明灭活疫苗（Progressis®）可以刺激猪体产生较高水平的中和抗体，却不能保护猪免受PRRSV的攻击；
Nilubol等（2004）[4]发现阳性猪接种灭活疫苗（PRRomiSe®）后产生较高水平的中和抗体，但不能抵御PRRS强毒株的攻击。Lopez等（2007）[5]研究表明仔猪中和抗体滴度达到1∶32才能完全保护，免于PRRSV感染。目前人们逐步把目光转移到IFN-γ（γ干扰素）和细胞因子，但它们之间的相关性仍不可靠，认为IFN-γ的升高很可能是受免疫佐剂的影响，属于非特异性免疫（Nilubol等，2004）[4]。
PRRSV的感染可分为两个阶段，即早期感染期和持续性感染期。病毒要完全被清除需要150 d或更长的时间。病毒感染7～9 d后，机体内可检测到高水平的特异性抗体，但这些抗体不具有中和活性；
中和抗体要在病毒感染4周左右才能产生，且效价较低。由于中和抗体产生较晚且不规则，因此在PRRSV的保护性免疫中没有发挥太大的作用。PRRSV持续性感染过程中，扁桃体等组织中存在较高滴度的病毒，而此时血清中有较高水平的中和抗体，因此认为中和抗体清除病毒的能力有限（李琳等，2020）[6]。
PRRSV GP5蛋白上N-糖基化作用对病毒的正确组装、靶向作用及生物学活性均起着重要作用。PRRSV GP5蛋白上的糖基化在逃避机体免疫或降低机体产生特异性中和抗体方面发挥着重要作用。病毒主要的中和作用决定子位于GP5蛋白上的N端外功能区，而这个蛋白上的一些特性，如“诱骗”表位和异质的糖基化作用隐藏了关键性中和作用位点，从而阻碍或降低了机体对病毒GP5蛋白上中和表位的体液免疫反应。这种N端聚糖遮蔽中和作用的特点在同属的LDV（乳酸脱氢酶病毒）上也被观察到，被认为是病毒免疫逃避及形成持续性感染的主要机制之一（李琳等，2020）[6]。
综上所述，由于PRRSV本身的特性，其感染或免疫之后中和抗体滴度一般不高，中和抗体作用有限。PRRS灭活疫苗产生的免疫主要为体液免疫，诱导细胞免疫的能力低，导致免疫效果不理想不能有效清除感染猪体内的病毒，常导致免疫失败。
2.1 PRRS灭活疫苗对母猪的免疫效力
Karniychuk等（2012）[1]使用PRRSV 07V63毒株制备灭活疫苗在后备母猪怀孕期27、55和83 d免疫3次，在怀孕期90 d时，试验组和对照组的后备母猪使用PRRSV 07V63毒株通过鼻内接种，接种后20 d安乐死所有后备母猪并采样。检测了疫苗免疫后和攻毒后血清中和抗体（图1）以及攻毒后血清PRRSV病毒载量（图2）。结果显示：试验组和对照组在攻毒前中和抗体滴度都很低，攻毒后试验组有所升高，但是对照组没有变化。对照组和试验组病毒载量差异不明显。结果还显示：试验组胚胎木乃伊比例8%，对照组15%；
胚胎着床位置有严重显微病理损伤的比例试验组为19%，对照组为45%（P＜0.05）；
试验组胎儿57% PRRSV阳性，对照组75% PRRSV阳性。上述试验结果显示，PRRSV 07V63毒株制备灭活疫苗在后备母猪的作用有限。虽然在一定程度上比未免疫对照组要好，但是也不能阻止PRRSV感染胚胎。
图1 疫苗免疫后和攻毒后试验组和对照组各后备母猪血清中和抗体
图2 攻毒后试验组和对照组各后备母猪血清中PRRSV滴度
Andrew等（2021）[8]用基因2型PRRSV MLV免疫后备母猪，然后用两个不同公司生产的PRRSV 1-7-4灭活疫苗分别加强免疫4次。试验分组：试验组1（免疫MLV），试验组2（免疫MLV+4次灭活疫苗1），试验组3（免疫MLV+4次灭活疫苗2）。后备母猪分娩的仔猪在2周龄时用PRRSV 1-7-4毒株攻毒，攻毒后4周安乐死并采样检测。中和抗体（NA）滴度结果显示：试验组1没有针对同源毒株PRRSV 1-7-4的中和抗体，试验组3中和抗体滴度达到1∶16，试验组2达到1∶128（图3A）；
而且母源血清中和抗体可以传递给其分娩的仔猪（图3B），不同组之间差异极显著（P＜0.000 1）（图3C）。仔猪攻毒后病毒血症结果：虽然每组都有病毒血症，但是试验组2比试验组3和试验组1都低，差异极显著（P＜0.01）（图4A）。攻毒后4周的增重结果显示试验组2最好（图4B）。肺脏大体病变和间质肺炎组织学评分试验组2最好（图4C、D）。上述试验结果显示，免疫PRRSV MLV后使用灭活疫苗加强免疫可以促进免疫反应，提高中和抗体滴度，而且母源中和抗体可以传递给后代仔猪，对于同源毒株的攻毒可以提供部分保护，保护不完全，试验组感染后4周都还有病毒血症，而且肺脏大体病变和显微病变都存在，但是，也可以看出来不同厂家生产的同一毒株的灭活疫苗效果还是有差异，灭活疫苗1效果要优于灭活疫苗2。
图3 自家灭活疫苗加强免疫可以诱导同源毒株的中和抗体并传递给仔猪
图4 母猪接种灭活疫苗可提高2周龄仔猪对PRRSV-2的免疫力：攻毒后不同周龄的病毒血症（A）和增重（B）；
肺脏大体病变（C）以及间质性肺炎组织学评分（D）
综上所述，PRRS灭活疫苗免疫母猪，如果是PRRSV阴性猪则中和抗体滴度一般较低，如果是感染过PRRSV或者免疫过PRRSV MLV则中和抗体滴度可能会明显提升。免疫灭活疫苗的母猪在受到PRRSV攻击的时候繁殖失败一样会比较明显，母源中和抗体传递给后代仔猪只能提供部分保护，病毒血症持续时间较长，组织发生病变，不能有效预防PRRSV感染。
2.2 PRRSV灭活疫苗对仔猪或生长肥育猪的免疫效力
Zuckermann等（2007）[1]使用商品化的弱毒疫苗Pyrsvac-183和灭活疫苗Progressis（佐剂为KV/ADJ）分别免疫5月龄猪，免疫28 d后用105.0TCID50PRRSV（Lelystad）攻毒，具体分组和采样见表1。结果显示：攻毒后4 d组2和组3（对照组）均有明显的病毒血症，差异不显著，但是组1没有病毒血症（图5）。解剖时肺脏和扁桃体PCR检测PRRSV结果：组2的肺脏90%阳性，组1的肺脏20%阳性，而且病毒载量比组2低，差异显著（P＜0.05）；
组1的扁桃体60%阳性，组2的扁桃体100%阳性；
总体上组2和组3载毒量差异不显著（图6）。血清中和抗体结果：组1免疫后28 d没有明显的中和抗体，而且攻毒后也没有唤醒免疫记忆反应产生明显的中和抗体；
组2疫苗免疫后产生了微弱的中和抗体，但是攻毒后唤起了免疫记忆反应，中和抗体明显升高，和组1相比还是较高，差异显著（P＜0.05）（图7）。检测外周血单核细胞（PBMC）中IFN-γ分泌细胞（IFN-γ-SC），结果显示：组1在28 d攻毒后IFN-γ-SC快速上升，7 d后继续明显升高，42 d开始衰减，而且有PRRSV刺激和没有刺激组差异显著，没有刺激组是非特异性细胞反应；
组3一直是没有明显的IFN-γ-SC上升；
组2免疫后21 d IFN-γ-SC快速上升，而且PRRSV刺激组和没有刺激组都快速上升，说明组2免疫产生的细胞免疫是非特异性的反应（图8）。上述试验结果表明灭活疫苗（Progressis）预防PRRSV（Lelystad）感染效果较差，优先选择MLV疫苗。
表1 试验分组设计
图5 各组血清病毒载量
图6 各组肺脏和扁桃体病毒载量
图7 各组血清中和抗体滴度（SVN）
图8 各组外周血单核细胞中IFN-γ-SC数量
Nilubol等（2004）[4]通过试验验证商品化的灭活疫苗（PRRomiSe®, Intervet, USA）在处理之前PRRSV感染猪的排毒影响，具体分组：组I（n=5）不攻毒的对照组，组Ⅱ（n=5）灭活疫苗对照组，组Ⅲ（n=20）攻毒对照组，组Ⅳ（n=20）攻毒+14、28 d灭活疫苗免疫两次，攻毒的组都是在0 d鼻内接种1 mL PRRSV VR-2385 105.4TCID50/mL。结果显示：病毒血症滴度和持续时间组Ⅳ和组Ⅲ无差异；
所有攻毒猪只到21 d都可以分离到病毒；
尸体剖检时，组Ⅲ扁桃体8/18可以分离到病毒，组Ⅳ扁桃体6/15可以分离到病毒，但是PCR检测PRRSV RNA，组Ⅲ和组Ⅳ所有猪的扁桃体都是阳性。中和抗体结果：组Ⅰ和组Ⅱ整个试验阶段都没有中和抗体；
组Ⅲ和组Ⅳ在攻毒后28 d中和抗体达到较高水平，但是差异不显著，在42 d差异显著（P＜0.05）（图9）。该试验表明仔猪感染PRRSV之后免疫灭活疫苗（PRRomiSe®, Intervet, USA），虽然可以诱导更好的体液免疫水平，但是没有缩短病毒血症和组织排毒时间，对于防控PRRSV感染没有起到相应的作用。
图9 各组对PRRSV VR-2385中和抗体平均值
蔡学辉等（2009）[9]分别采用PRRSV CH-1R致弱疫苗株和变异毒株灭活疫苗免疫40～45日龄仔猪，免疫接种后4周，用HP-PRRSV HuN-4变异株强毒攻毒，攻毒后21 d剖检，取主要器官作病理组织学观察和病毒抗原定位。结果显示，变异毒株灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组（表2）。该研究结果表明，CH-1R弱毒疫苗对HuN-4强毒免疫保护效果好于变异毒株灭活疫苗。
表2 PRRSV抗原免疫组化检测结果
李福泉等（2021）[10]对由ISA201VG和ISA70VG佐剂分别制备的2种NADC30-PRRSV SY株灭活疫苗的免疫效果进行比较研究。选用35日龄PRRSV抗体和抗原均为阴性的健康仔猪15头，随机分为3组：试验组1（ISA201VG免疫组）、试验组2（ISA70VG免疫组）和对照组（未免疫攻毒组）。试验组首免107.0TCID50/头，间隔21 d后以相同剂量进行二次免疫，采用ELISA法检测PRRSV血清抗体，结果显示：免疫后第35天，试验组2的5头猪PRRSV抗体转阳率达100%，试验组1的5头猪PRRSV抗体转阳率达40%（图10）。二免后14 d采用NADC30-PRRSV SY株攻击试验猪，攻毒剂量为1×105.0TCID50/mL，检测各组猪体温变化，结果显示：试验组2从攻毒后第8天起体温超过40 ℃，持续6 d；
试验组1的5头猪只有1头体温超过40 ℃；
对照组5头猪攻毒后第11～13天体温升至40 ℃持续3 d（图11）。各组猪增重检测显示：试验组2与对照组相比较，体重呈现负增长且体重减少均在5%以上，而试验组1与对照组相比较，体重呈现正增长且增长均在7%以上（图12）。对PRRSV感染后两个试验组肺组织病理观察均可见肺脏呈局限性间质性肺炎和淤血，并伴有血栓、部分肺泡隔增宽，支气管周围有淋巴细胞浸润伴有间质性肺炎，但试验组2比试验组1组织病变更加严重（表3）。本试验结果表明ISA201VG佐剂效果更好，同时证实类NADC30-PRRSV（SY株）制备的灭活疫苗对于同源毒株的攻毒保护较差，不宜制备灭活疫苗免疫。
图10 不同佐剂配制的PRRSV灭活疫苗接种猪后的抗体变化
图11 类NADC30-PRRSV/SY株攻毒后各组猪的体温变化
图12 类NADC30-PRRSV/SY株攻毒后各组猪的体重变化
表3 两种佐剂制备的PRRSV灭活疫苗免疫猪攻击NADC30-PRRSV/SY株后的组织病理变化
PRRSV毒株的快速变异导致毒株多样性，并且部分猪场存在多个谱系毒株共存的情况，增加了防控PRRS的难度，猪场为了稳定蓝耳病，选择使用弱毒疫苗和灭活疫苗联合使用，但是前面试验数据已经证实效果甚微。试验条件下或田间条件下，单纯使用灭活疫苗或者是之前感染过PRRSV的阳性猪群再使用灭活疫苗，对于减少排毒时间和排毒量以及提高生产成绩作用有限。
综上所述，PRRSV灭活疫苗一般很难产生或者产生的中和抗体滴度较低，而且刺激产生的细胞因子反应一般也认为是佐剂的作用，属于非特异性免疫反应，大部分试验数据显示在预防PRRSV感染、减少排毒、提高生产成绩方面效果甚微。
免疫PRRS弱毒疫苗或者猪只感染过PRRSV之后，再免疫灭活疫苗，是否会激发更好的体液免疫和细胞免疫，这方面有正面的报道，也有反面的报道，总体对防控PRRSV感染和减少排毒作用有限。Nan等（2017）表示PRRSV灭活疫苗的潜在功效作为治疗疫苗比疾病预防疫苗作用要强。
当然，PRRS防控需要综合措施，如生物安全、疫苗免疫、后备母猪隔离驯化和防控继发细菌疾病等，不能完全依赖疫苗免疫。目前很多种猪企业PRRSV净化提上日程，PRRSV灭活疫苗有一定的用武之地，可以在准备净化PRRSV的猪场稳定之后，种猪群免疫使用。
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