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王雪娟 宋玉霞 崔培林 李建彪 石晶 魏会娟
子宫内膜异位症是育龄期女性最常见疾病之一，发病率占育龄期女性的10%左右[1]。临床症状主要有：腹痛(进行性痛经、性交痛、慢性盆腔痛)和不孕，大约50%的子宫内膜异位症患者伴有盆腔痛，40%～50%的患者合并不孕症，严重影响了患者身心健康和生活质量[2]。因此，对影响子宫内膜细胞在异位处存活、侵袭、生长等因素进行分子机制研究，可完善内异症的发生机制，而且有助于确定内异症治疗的潜在分子靶点。越来越多的证据表明微小RNAs(miRNAs)在人类肿瘤发生、发展及治疗转归过程中起重要作用[3-5]。miR-205是一种重要的miRNA分子。生物信息学软件分析表明miR-205可靶向调控血管内皮生长因子A(VEGFA )的表达，且在肿瘤的研究中也证实miR-205可直接靶向作用VEGFA[6-8]。子宫内膜异位症虽然是一种良性疾病，但具有种植、侵袭、复发等恶性生物学行为，血管生成是异位病灶处存活和发展的关键因素之一。因此，本研究拟检测miR-205和VEGFA在卵巢子宫内膜异位症患者在位、异位内膜中的表达情况，探讨二者的作用，并分析二者表达水平的相关性。
1.1 一般资料 收集2019年12月至2021年6月于石家庄市人民医院妇科住院行腹腔镜手术治疗的50例卵巢子宫内膜异位症患者(病例组)在位内膜和异位内膜组织。所有患者经术后病理证实为卵巢子宫内膜异位症，根据美国生育学会修正的分期标准(r-AFS)分期为Ⅲ、Ⅳ期卵巢子宫内膜异位症。收集同期因卵巢冠囊肿行腹腔镜手术或行腹腔镜下输卵管结扎术患者的正常内膜组织55例为对照组，术中排除患有子宫内膜异位症。病例组年龄21～40岁，平均年龄(36.5±6.7)岁；
对照组年龄23～42岁，平均年龄(37.6±5.6)岁。2组患者年龄分布匹配，差异无统计学意义(P>0.05)。2组患者均月经规律，内膜收集均在月经周期的分泌期(末次月经时期及病理特征来确定)，且2组患者术前6个月内均未应用激素类药物。标本收集及临床资料经患者及家属知情同意。组织标本均在离体后30 min内收集，放入装有RNAlater 液的EP管里浸泡，4℃冰箱过夜后转入-20℃保存。此项研究获石家庄市人民医院医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂 TRIzol试剂 购于天根生化科技有限公司；
RNA逆转录试剂盒购于TaKaRa生物技术有限公司；
Quantinova TMSYBR green pcr Kit试剂盒购于上海凯杰生物技术有限公司；
miRNA提取试剂盒和miRNA逆转录试剂盒 购于美国Invitrogen公司；
miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒购于美国Invitrogen公司；
PCR扩增引物序列上海生工生物工程有限公司。
1.3 检测方法
1.3.1 内膜组织总RNA提取及合成cDNA：
应用TRIzol抽提对照内膜、在位内膜、异位内膜组织总RNA，应用Nanodrop2000检测其浓度和纯度后，RNA逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA。miRNA提取试剂盒抽提上述在位、异位及对照内膜组织的miRNA，Nanodrop2000检测其浓度和纯度，miRNA逆转录试剂盒将提取的miRNA逆转录成cDNA，保存于-20℃冰箱。
1.3.2 VEGFA和miR-205表达水平检测：
目的基因VEGFA的表达水平应用PCR扩增来检测，使用QuantiNova TMSYBR green pcr Kit试剂盒按说明书操作进行。反应体系为：Mix液10.0 μl、Rox 0.1 μl、cDNA模板1.0 μl、上下游引物各1.4 μl、最后加去离子水至20 μl。反应引物序列：目的基因VEGFA的上游引物为5’-ACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCAT-3’，下游引物为5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTGCAAGT-3’；
GAPDH为内参基因，其上、下游引物序列为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’和5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。目的基因miR-205的表达水平检测应用miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒按说明书操作进行PCR扩增，反应体系为：Mix液5.0 μl、上下游引物各1.0 μl、cDNA 模板1.0 μl、最后加去离子水至10 μl。反应引物序列：目的基因miR-205的上游引物为：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCTTCATTCC-3’，下游引物为：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAG
TCGGCAATTCAGTTGAGCAGACT-3’；
内参U6基因的上游引物为5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，下游引物为5’-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’。每个组织样本设置3个副孔，VEGFA和miR-205在不同内膜组织中的相对表达量应用2-△△CT法计算获得。
2.1 VEGFA基因mRNA在异位、在位和对照内膜中表达情况 与在位和对照内膜相比，VEGFA基因mRNA在异位内膜中的表达量显著增加，差异均有统计学意义(P<0.001)；
且在位内膜组织中VEGFA基因mRNA的相对表达量显著高于对照内膜组织(P<0.007)。见表1。
表1 VEGFA基因mRNA在不同内膜组织中表达情况
2.2 miR-205在不同内膜中的表达 异位内膜组织中miR-205的表达量显著低于在位和对照内膜，差异均有统计学意义(P<0.01)；
且在位内膜组织中miR-205的相对表达量显著低于对照内膜，差异有统计学意义(P<0.009)。见表2。
表2 miR-205在不同内膜组织中表达情况
2.3 异位内膜组织中VEGFA和miR-205表达水平相关性 Pearson分析结果显示：miR-205与VEGFA基因mRNA在异位内膜组织中的表达量呈显著负相关，差异有统计学意义(r=-0.637，P<0.05)。见表3。
表3 异位内膜组织中miR-205和VEGFA基因mRNA表达的相关性
2.4 异位内膜组织中miR-205表达对卵巢子宫内膜异位症的诊断意义 结果提示miR-205诊断卵巢子宫内膜异位症的ROC曲线下面积(AUC值)为0.918，95%可信区间为0.858～0.978，与AUC=0.5比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明异位内膜组织中miR-205表达对卵巢子宫内膜异位症的诊断具有较高的准确性。最优截断点为0.7665，在最优截断点灵敏度和特异度分别为83.6%和98.0%。见图1。
图1 异位内膜组织中miR-205表达水平判断卵巢子宫内膜
miRNAs是一类广泛分布于组织细胞的内源性非编码单链小分子RNA，长度约19～25个核苷酸，具有高度保守性、时序性和组织特异性，通过与靶基因mRNA的 3"UTR结合引起mRNA降解或者抑制其翻译来调控基因表达。国内外学者们对大肠癌、肺癌、卵巢癌、肝癌等恶性肿瘤的研究表明肿瘤组织中miRNAs呈不同的表达，异常表达的miRNAs参与肿瘤的发生、转移、侵袭及预后等过程[9-12]。子宫内膜异位症具有恶性肿瘤相似的生物学特性，其发生和发展是多个基因参与的、错综复杂调控网作用的结果，miRNAs与子宫内膜异位症发病机制的研究日渐关注。研究证实miRNA在子宫内膜异位症患者在位内膜和异位病灶中的表达存在显著差异，这些异常的miRNA通过调控靶基因及其下游的信号通路参与子宫内膜异位症的形成[13-15]。
miR-205是miRNAs家族重要成员之一，研究表明其在多种肿瘤的发生、发展过程中起作用。先前的文献报道了miR-205在子宫内膜癌、卵巢癌中表达上调，而在甲状腺乳头状癌、大肠癌中表达下调，表明miR-205根据肿瘤组织和类型的不同发挥不同的作用，既可作为癌基因促进肿瘤发生，又可作为抑癌基因而起到抑制肿瘤生成的角色[16-19]。本研究检测了miR-205在异位内膜、在位内膜及对照内膜中的表达情况，发现卵巢子宫内膜异位症患者异位内膜组织中miR-205的表达水平显著低于在位内膜及对照内膜，且在位内膜组织中miR-205的表达水平显著低于对照内膜。
生物信息学软件分析显示miR-205可靶向调控VEGFA的表达，且在肿瘤的研究中也证实miR-205可靶向作用VEGFA的表达。Zhao等[6]研究发现表达上调的miR-205通过降低VEGFA水平来抑制肝癌细胞的增殖和转移。Cao等[7]研究表明表达下调的miR-205通过靶向上调VEGFA表达来促进膀胱癌的发生和发展。此外，Wang等[8]报道了卵巢癌中miR-205也通过作用VEGFA来调控肿瘤细胞增殖及凋亡。以上研究结果均表明miR-205通过调控VEGFA起作用，但miRNA具有组织特异性，子宫内膜组织中miR-205是否调控VEGFA表达目前尚未见报道。本研究通过Pearson相关性分析发现异位病灶中miR-205的表达水平与VEGFA基因mRNA的表达量呈显著负相关性，这些结果表明表达下调的miR-205可能通过靶向调控VEGFA表达来促进卵巢子宫内膜异位症发生发展。
VEGFA是一种血管内皮细胞有丝分裂原，具有维持血管内皮细胞通透性和促进血管生成的功能，是调控血管生成的关键蛋白因子。先前的研究报道了子宫内膜异位症患者血清及异位病灶中VEGFA的表达水平显著高于对照患者，且随着病情的加重而升高[20-23]。与先前的结果一致，本研究应用RT-qPCR检测了卵巢子宫内膜异位症患者在位和异位内膜组织中VEGFA基因mRNA的表达，结果显示异位内膜组织中VEGFA的表达量显著高于在位和对照内膜组织，且在位内膜组织中VEGFA的表达量显著高于对照内膜。血管生成是异位病灶处存活和发展的关键因素之一，经血逆流入腹腔的内膜组织，在异位处黏附形成新生血管，从而在异位处存活并发展成异位病灶。因此，我们的研究结果表明表达下调的miR-205可能通过靶向上调VEGFA，导致新生血管生成增多，从而促进卵巢子宫内膜异位症发生和发展。当然，我们的结果需要更进一步的验证，并需要在内膜细胞上应用荧光素酶报告基因载体实验进一步验证miR-205与VEGFA的靶向关系。
综上所述，表达下调的miR-205可能通过靶向调控VEGFA的表达来促进卵巢子宫内膜异位症的发生和发展。进一步探索miR-205在卵巢子宫内膜异位症发生中的作用机制，可为卵巢子宫内膜异位症的早期诊断及治疗提供新思路。
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