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蔡 涛 宋小兵
1江汉大学附属湖北省第三人民医院胃肠外科 湖北 武汉 430030；
2武汉大学中南医院急救中心 湖北 武汉 430071
肝癌是最常见的恶性肿瘤，具有恶性程度高、较早发生侵袭和血性转移、预后差等特点。我国为肝癌的高发区，肝癌严重威胁着我国人民的生命和健康，是我国恶性肿瘤的第二位死因，5 年存活率仅20%～30%［1，2］。近年来研究表明，非编码小分子同微小RNA（miRNAs；
miR）在肝癌的发生发展中起着关键性作用，作为生物标志物在恶性肿瘤的诊断或预后中具有重要意义。miRNAs 是一种长为18～25 bp 的真核生物内源性小分子单链RNA，通过miRNA 与靶mRNA 的3"端非翻译区结合，从而影响mRNA 的稳定性或抑制蛋白的翻译而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的作用［3］。miRNA 调 控 约1/3 的蛋白编码基因，并且参与了包括细胞增殖、分化等在内的诸多生理生化过程。近年来有关已有大量研究表明多种miRNA 与肝癌的发生、发展、转移及预后存在密切关系。
在真核生物体内，miR-17-92 基因簇作为miRNA 的重要成员，由6 个成熟的miRNA 组成，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a 和miR-92a，已被证实在肝癌［4，5］、肺癌［6］、前列腺癌［7］、乳腺癌［8］、胃癌［9］、结直肠癌［10］等多种恶性肿瘤中表达失调，且与肿瘤的分期、转移等密切相关。因此，本文主要研究miR-19a 在肝癌中的表达情况，探讨其在肝癌患者诊断及预后中的临床价值。miR-19a作为一种新型肿瘤标志物具有非常重要意义，也为药物的靶向研究提供理论依据和新的治疗前景。
1.1 患者资料及样本收集选取武汉大学中南医院自2016—2018 年普外科收治的肝癌患者病理切片中100 例冻存肝癌组织及其对应的癌旁组织标本，本研究经患者同意并签署知情同意书。其中男性55例，女性45 例，年龄10～75 岁，年龄＜60 岁患者48例，年龄≥60 岁患者52 例。随访1～36 个月，其中随访期间总死亡31 例。Enneking 外科诊断分期：Ⅰ期及Ⅱa 期病例63 例，Ⅱb 期及Ⅲ期37 例（P＜0.05）。
1.2 PCR 实验方法按照说明，将组织使用TRIzol 及 氯 仿 提 取RNA。取1 μg 总RNA 反 转 录成cDNA，以cDNA 为模板，用Real-Time PCR 内参基因GAPDH 引物做q-PCR 扩增，检测基因miR-19a 的表达水平。Real-Time PCR 反应体系：SYBR®Premix ExTaqTMⅡ（2×）25 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）2 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）2 μL，ROX Reference Dye（50×）1 μL，DNA 模板4 μL，ddH2O（灭菌蒸馏水）16 μL；
反应条件：95 ℃、30 s 一个循环，然后95 ℃、5 s，60 ℃、30 s进行40 个循环。每一个基因的表达水平以其相对内参GAPDH 的水平的形式呈现，使用的PCR 引物见表1。用GraphPad Prism 6 软件进行定量和分析，最后结果以2-△△Ct分析。
表1 目的基因PCR 实验引物序列
1.3 Western Blot 实验方法收集细胞后加入1 mL RIPA 裂解液，用玻璃匀浆器在冰上匀浆；
10 000 r/min 离心5 min，取上清，加入等体积2×loading buffer，沸水煮5 min，冷却后进行SDSPAGE 电泳，采用200 V 的电压，电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部时停止，并转膜、封闭后，加入一抗4 ℃过夜，二抗室温1 h，最后在暗室中胶片曝光。
1.4 双荧光素酶报告基因实验PTEN 3"UTR 与miR-19a 的结合序列通过TargetScanHuman version 7.1（www. targetscan. org/vert_71/）预测其潜在结合位点。将具有萤光素酶活性和肾素酶活性的pGL3-荧光素酶载体（武汉金凯瑞生物工程有限公司，武汉）用XbaⅠ酶剪切，插入目的基因序列。将含有结合位点的PTEN 3"UTR 启动子序列合成为野生型（WT）质粒（PTEN-WT）；
同样，PTEN 的突变结合位点构建为突变型（MT）质粒（PTENMT）。使用Lipofectamine 2000（5 μL）进行细胞转染48 h。然后收集并裂解各组共转染细胞使用双荧光素酶报告基因实验系统（Promega，美国），测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。
1.5 数据分析计量资料采用非配对t检验，计数资料行卡方检验，数据均应用统计学软件SPSS 22.0进行分析。当P＜0.05 时，则差异具有统计学意义。
2.1 miR-19a 与肝癌患者临床病理因素的关系
收集统计患者的临床数据，统计分析表明，miR-19a的表达与患者性别、年龄没有统计学差异，两组患者具有可比性。患者miR-19a 的表达与血甲胎蛋白（AFP）值无明显统计学差异（P＞0.05）。miR-19a的表达与肝癌患者肿瘤大小及TNM 分期有关，低表达的miR-19a 与较小的肿瘤体积（P=0.001，表2）和较低的TNM 分级有关（P=0.001，表2）。
表2 肝癌组织miR-19a 水平与患者临床病理参数之间的相关性
2.2 miR-19a 在肝组织及癌旁非肿瘤组织中的表达及预后的影响100 例肝癌肿瘤患者手术切除的标本中，肿瘤组织中miR-19a 表达水平明显高于对应的癌旁组织（P＜0.001，图1A 和1B）。将肿瘤患者分为miR-19a 高表达组（n=49）和低表达组（n=51）。所有患者均获得随访，末次随访时间为2018年12 月。随访时间1～36 个月，因复发转移死亡患者总共有31 例。随访结果表明，miR-19a 低表达组患者3 年无肿瘤复发率明显高于miR-19a 高表达组（P＜0.05，图1C）。miR-19a 低表达组患者3 年生存率明显高于miR-19a 高表达组（P＜0.05，图1D）。
图1 q-PCR 检测miR-19a 在肝癌组织及其癌旁组织中的表达及对预后的影响
2.3 miR-19a 对PTEN 及其下游基因相关通路蛋白的影响转染miR-19a inhibitor 后抑制miR-19a的表达。RT-PCR 结果表明，下调的miR-19a 可促进PTEN mRNA 的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05，图2A）。同时Western Blot 结果表明，下调的miR-19a 可促进PTEN 蛋白的表达，并影响下游Akt 蛋白的表达（图2B）。
图2 抑制miR-19a 可促进PTEN 的表达
2.4 miR-19a 靶向调节PTENmiR-19a inhibitor和WT-PTEN-3"UTR 共转染可抑制萤光素酶活性（P＜0.05），而用Mut-PTEN-3"UTR 转染的细胞在有或没有miR-19a inhibitor 的情况下，UTR 均未表现出荧光素酶活性的改变（图3）。
图3 双荧光素酶报告基因实验验证miR-19a靶向作用于PTEN 结合位点
肝癌是最常见的原发性恶性肿瘤，肝癌的早期诊断和治疗越来越迫切。寻找高灵敏度、高特异度的生物标志物在肝癌的筛查和早期诊断中越来越重要的临床应用价值和前景。
研究表明microRNAs 在肝癌的筛查、诊断和预后判断中具有重要意义。其中miR-17-92 与人类癌症的发病密切相关，在多种恶性肿瘤中表达上调，包括结肠癌、B细 胞 淋 巴 瘤、胃 癌 和 小 细 胞 肺 癌［11］。miR-19a 是miR-17-92 家族中重要的成 员［12］。miR-17-92 基因簇定位于13q31.3（即13 号染色体25 号开放阅读框的3 号内含子区域）。该基因编码产生6 个成熟的miRNAs：miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b 和miR-92a［13］。
miR-19a 作为miR-17-92 基因簇基因的重要成员，促进其表达可提高PTEN 的活性及有效含量，提高PTEN 基因启动子的表达水平，形成一个开放的染色质结构，促进与转录因子Egr-1 的结合，进而诱导基因的表达［14，15］；
同时增强PTEN 蛋白与目标蛋白PDZ 结合序列的相互作用，从而加强PTEN 的作用效应，抑制PTEN/PI3K/Akt 信号转导通路，阻滞肿瘤生长［16-18］。
由于肝癌具有较早发生转移的特点，本研究发现，miR-19a 在癌组织的表达明显高于其对应的癌旁组织；
且高表达与肿瘤的病理分期密切相关［19，20］；
远处转移率也明显高于低表达组。下调miR-19a 可靶向调节PTEN/Akt 通路从而发挥抑制肿瘤细胞的作用。因此，miR-19a 通过参与细胞信号通路的调节而影响肿瘤增殖的生物学特性，具有作为肝癌生物标志物的潜力。预后分析表明miR-19a 的表达情况与肝癌患者预后密切相关，因此，作为肝癌预后生物标志物，miR-19a 具有重要的应用前景和临床应用价值。
