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张 成， 姚兴东*， 雷福厚
(1.广西林产化学与工程重点实验室，广西民族大学，广西南宁 530006;2.广西林产化学与工程协同创新中心，广西民族大学，广西南宁 530006)
岩黄连为罂粟科紫堇属多年生草本植物石生黄堇(CorydalissaxicolaBunting)的全草，主要分布于我国广西、云南、贵州、四川等地，常用作肝病等疾病的治疗[1]。研究表明，岩黄连的有效成分是以脱氢卡维丁为代表的生物碱类化合物，主要为脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱3种生物碱，具有抗肿瘤、保肝、抗肝炎病毒、抗菌等药理活性[2 - 5]，通过测定草药中这3种生物碱的含量可实现中草药的质量控制[6 - 8]。由于这几种生物碱均为强碱性季铵盐类生物碱，其结构与性质非常相似，因此增加了分离的难度。已有文献报道均使用ODS色谱柱进行分离[9 - 11]。但我们的实验表明，由于这3种生物碱分子的极性较大，在ODS色谱柱上保留值较小，很多情况下难以实现这3种生物碱完全分离。通过增加固定相极性，提高这3种生物碱在色谱柱上的保留值，有望改善分离效果。SiO2@松香基高分子(Ru131)柱是我们课题组以天然松香为原料开发的新型高效液相色谱柱，由于其含有羧基，有助于生物碱在色谱柱上的保留和分离，已在喜树碱、吴茱萸、咖啡因等生物碱的分离中得到了应用[12,13]。
本文在SiO2@松香基高分子(Ru131)色谱柱上，优化色谱分离条件，建立了一种测定岩黄连中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量的液相色谱分析方法。方法线性范围宽，回收率高，结果准确，为测定中草药中有效成分脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量、评价岩黄连的质量标准提供依据。
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪(LC-15 C，日本岛津公司)；
装柱机(CP-24，美国科学系统公司)；
不锈钢空液相色谱柱管(250 mm×4.6 mm，大连依利特分析仪器有限公司)。
马来海松酸丙烯酸乙二醇酯(EGMRA)(98%，广西梧州日成林产化工股份有限公司)、甲基丙烯酸(MMA)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、脱氢卡维丁(纯度>99%，上海源叶生物科技有限公司)、盐酸巴马汀(纯度>98%，阿拉丁生化科技股份有限公司)、盐酸小檗碱(纯度>98%，阿拉丁生化科技股份有限公司)；
乙腈、甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)；
NaH2PO4(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。水为二次超纯水。
岩黄连药材干草购于南宁市广耀实验装备有限责任公司，产自广西大化县，经粉碎后备用。
1.2 色谱固定相的制备
Ru131固定相参照文献的方法[12]合成。基质使用5 μm球形硅胶(苏州纳微科技股份有限公司)。固定相采用匀浆法将填料填入250 mm×4.6 mm色谱柱。
1.3 生物碱对照品溶液的配制与样品处理
对照品混合溶液的配制：称取适量脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品，以甲醇分别配成质量浓度为0.2180 mg·mL-1脱氢卡维丁、0.2120 mg·mL-1盐酸巴马汀和0.2060 mg·mL-1盐酸小檗碱的对照品储备溶液。分别吸取适量各对照品储备溶液混合，以甲醇稀释成相应浓度的对照品混合溶液。
供试品溶液的配制：参照文献的方法[14]，精确称取岩黄连粉末2.0000 g，加入150 mL含1%HCl的甲醇溶液，索氏提取8 h后，旋蒸浓缩，并用甲醇定容至100 mL。取适量该溶液，过微孔滤膜(0.22 μm)后，进行液相色谱分析。
2.1 Ru131固定相的表征
文献[12]曾采用傅立叶红外(FTIR)光谱、核磁共振(NMR)、扫描电镜(SEM)等方法表征了Ru131色谱固定相，结果表明有机基团成功地键合到硅胶表面。我们的实验结果也与文献报道一致。此外，参照文献的方法[13]测定了合成时不同EGMRA∶MMA比例所得固定相的酸值，当单体比例分别为5∶1、5∶1.5、5∶2 和5∶3 时，固定相的酸值分别为0.07420、0.09423、0.1070和0.1154 mmol/g。这表明增加MMA用量可以增加固定相中羧基的含量，从而增强其与生物碱的作用，延长生物碱在色谱柱上的保留并改善分离效果。
2.2 色谱分离条件的优化
2.2.1 Ru131固定相的单体比例对分离效果的影响将0.08000 mg/mL的混合对照品溶液分别以不同的Ru131液相色谱柱进行分离。在不同单体比例(EGMRA∶MMA)合成所得SiO2@松香基高分子(Ru131)色谱柱上，以乙腈-0.0050 mol/L磷酸缓冲溶液为流动相时，脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱均能实现分离，随着固定相中MMA的含量增加，3种生物碱的保留时间均增大。这是因为增加MMA含量后，固定相上的羧基含量也相应增加，增强了羧基与生物碱正离子间的库仑力作用。当单体比例达到5∶2 时，继续增大MMA的比例，3种生物碱的保留时间并无明显增加。在单体比例为5∶2 时3种生物碱在SiO2@松香基高分子(Ru131)柱上分离效果最好，后续实验均采用此色谱柱进行分离。
2.2.2 流动相中乙腈浓度对分离效果的影响以乙腈-0.0050 mol/L磷酸缓冲溶液(pH=3.0)为流动相时，当乙腈浓度从40%降低到20%，脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱3种生物碱的保留时间随乙腈浓度的降低而逐渐增加。当乙腈-磷酸盐缓冲溶液混合比为20∶80(V/V)时分离效果好且保留时间适中。因此实验中选择乙腈-磷酸缓冲盐溶液(pH=3.0)作为本实验的流动相。产生这一现象的原因主要是由于固定相和3种生物碱均有大的非极性基团，因此两者之间存在较强的色散力作用，也表现出反相色谱的特性。随着流动相中乙腈浓度的降低，生物碱的保留时间变长，分离度增大。但当乙腈浓度低于20%后，3种生物碱的保留时间过长，峰形也较差，分离度反而下降。因此，流动相中适宜的乙腈浓度为20%。
2.2.3 流动相pH对分离效果的影响调节磷酸缓冲溶液的pH分别至3.0、4.0和5.0。以不同pH的流动相对混合对照品溶液在Ru131柱上进行色谱分离。结果如图1所示，随着流动相的pH增高，脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的保留时间变长。这是因为SiO2@松香基高分子(Ru131)柱中存在羧基，在流动相pH较低时主要以—COOH形式存在。而当pH增大时羧基发生解离以—COO-的形式存在，后者与带正电荷的生物碱之间的库仑力作用更强，因此保留时间增加。但由于随着保留时间的增长，色谱峰变宽，3种生物碱间的分离度并无明显改善。因此后期实验中均选用pH=3.0的流动相。
图1 不同pH流动相分离脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的色谱图
2.3 草药岩黄连中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的测定
2.3.1 供试品溶液与混合对照品溶液色谱图综合以上实验，最佳色谱分离条件为：乙腈-0.0050 mol/L磷酸缓冲溶液(pH=3.0)=20∶80(V/V)，流速1.00 mL/min，柱温30 ℃，检测波长347 nm，进样量20 μL。分别对岩黄连混合对照品溶液与岩黄连供试品溶液进行分离，结果如图2所示。在此条件下脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱可实现良好的分离，且与草药岩黄连中其他组分均有很好的分离。
图2 岩黄连溶液的色谱图
2.3.2 标准曲线分别精密吸取适量体积的上述对照品溶液，配制成混合对照品溶液。按照“2.3.1”的条件进行测定，分别以脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的色谱峰面积为纵坐标(Y)，混合对照品溶液中各生物碱的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。3种生物碱的相关回归方程、相关系数和线性范围列于表1。
表1 脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的线性方程、线性范围和相关系数
2.3.3 精密度实验精密吸取含有脱氢卡维丁25.11 μg·mL-1、盐酸巴马汀13.74 μg·mL-1、盐酸小檗碱5.93 μg·mL-1的混合样对照品溶液20 μL，根据“2.3.1”色谱条件，连续进样10次，以3种生物碱的峰面积计算结果的相对标准偏差(RSD)。脱氢卡维丁、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为0.45%、0.58%和2.56%。表明结果具有较高的精密度。
2.3.4 稳定性试验按照“1.3”的方法制备岩黄连供试品溶液，分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样分析测定。结果显示，24 h内脱氢卡维丁、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的RSD分别为2.5%、2.7%、0.42%，表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定。
2.3.5 重复性试验取同一批岩黄连药材粉末，并按照“1.3”的方法配制供试品溶液6份，以“2.3.1”中液相色谱条件测定。结果发现，脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量测定结果的RSD分别为1.91%、2.29%和2.27%，表明分析结果有较好的重现性。
2.3.6 加入回收试验精密量取已知含量的样品溶液9份，分别加入相当于岩黄连样品中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱80%、100%、120%含量的对照品，用1%HCl甲醇溶液定容后，按前述方法进样测定，分别计算3种生物碱的加样回收率，结果如表2所示。
表2 脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的加样回收率测定结果
2.3.7 样品含量测定取岩黄连药材粉末，按照“1.3”的方法平行制备3份供试品溶液，并按照色谱条件依次进样测定，测得样品中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量分别为0.9894%、0.6655%、0.1694%，即3种生物碱总含量为1.824%。
采用SiO2@松香基高分子(Ru131)色谱柱，对岩黄连中脱氢卡维丁、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量进行分离测定，和ODS柱相比，3种生物碱的保留值和分离度均明显增加，且岩黄连中除3种生物碱外的其他物质在此色谱柱上保留时间较短，能与3种生物碱可完全分离从而不会影响测定。这表明与ODS柱相比，SiO2@松香基高分子(Ru131)色谱柱更适用中草药中生物碱的分析检测。
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