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夏雨婷,万永杰,姜志洋,陈琪,茆达干
(南京农业大学动物科技学院,江苏 南京 210095)
我国南部地区夏季高温高湿常引起动物热应激,损害动物的健康福利,降低动物的免疫、生长和繁殖性能。热应激能激活下丘脑-垂体-肾上腺轴,升高皮质酮分泌水平,诱导免疫抑制[1],降低抗氧化能力[2];导致羔羊采食量、肌肉生长和代谢效率降低,从而降低生产性能[3];引起睾丸代谢增加导致精索损伤[4],雄性动物的性欲、精子活力和精液质量降低[5],雌性动物发情周期紊乱、妊娠母畜和子代产生应激反应[6]。
如何减轻热应激给畜牧生产中带来的经济损失已引起人们的广泛研究。如通过建造人工围栏遮蔽物、喷水器以及围栏洒水器等物理方法,降低夏季高温给动物带来热应激损伤[7],但这些方法也存在引起动物不良反应的问题;通过添加植物源性物质如槲皮素[8]、当归粉[9]和红参[10]等,可以有效改善夏季高温带来的负面影响且满足动物福利要求。硒是动物必需的微量元素,是抗氧化酶系统中不可或缺的辅助因子。高温季节日粮添加有机硒能通过富含硒代半胱氨酸的硒蛋白发挥抗炎、抗氧化应激作用,保护动物的肝脏[11]、肾脏[12]和睾丸[13]等器官,继而改善热应激造成的生产、繁殖性能低下。有学者基于转录组学研究发现,日粮添加有机硒后绵羊的血液基因表达发生变化,共检测出1 186个差异基因[14]。热应激对哺乳动物的精子产生不利影响,甚至可能导致子代不育[15]。然而,针对有机硒缓解热应激对绵羊睾丸损伤的转录组学研究还未见报道。本试验以4月龄雄性湖羊为研究对象,通过在夏季日粮添加酵母硒,研究其对湖羊血液指标和睾丸发育的影响,对睾丸组织进行转录组学分析,探讨夏季日粮添加酵母硒影响湖羊睾丸发育相关基因表达变化规律,从分子水平为酵母硒应用于夏季湖羊生产中提供科学依据。
1.1 试验动物与材料
选取体况健康、体重相近的4月龄雄性湖羊为研究对象,在启东瑞鹏牧业有限公司进行试验。当地7—8月份的日平均温度为(36±3)℃,日平均湿度为(75±10)%,羊舍内每天的平均温度为(34±2)℃,平均湿度为(75±10)%。酵母硒购于南京嘉吉饲料有限公司,硒含量为3 g·kg-1。
1.2 试验设计
96只试验羊(平均体重约25 kg)随机分为对照组(Con,基础日粮)和酵母硒组(Se,基础日粮+酵母硒),每组3个重复,每个重复16只羊。试验饲养周期为5周(其中预饲期1周),基础日粮组成见表1。采用精粗分饲的方式,分别于每日07:00和17:00饲喂。酵母硒添加量按干物质采食量(dry matter intake,DMI)0.4 g·kg-1计算拌于精料内。试验结束时于次日晨饲前进行称重,每个重复选4只羊进行颈静脉采血,制备血清和血浆,-20 ℃保存。每个重复选2只羊采集睾丸,称重并测量大小,然后取部分组织用多聚甲醛固定,部分组织于-80 ℃保存。
1.3 血液生化指标与免疫指标
血清葡萄糖(Glu)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(NEFA)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)浓度测定按照试剂盒(南京建成生物科技有限公司)说明书进行。血浆免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和M(IgM)浓度测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法,根据试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)说明书操作。
1.4 血液与睾丸组织的抗氧化指标
血清和睾丸组织中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性测定按照试剂盒(南京建成生物科技有限公司)说明书进行。
1.5 睾丸组织硒浓度及组织形态学分析
按照《食品安全国家标准食品中硒的测定:GB 5009.93—2017》的操作方法,将保存在-80 ℃的睾丸样品(约0.3 g)解冻后与硝酸(10 mL)混匀,使用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(赛默飞iCAP 7400,美国)测定湖羊睾丸组织中的硒浓度。每个样品取3个平行样,取实测数据的均值。睾丸组织形态学操作步骤参照Pang等[16]方法,将固定的睾丸组织进行石蜡包埋,制作连续切片(厚5 μm),苏木精和伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察,测量曲精细管外径、内径,计算生精上皮的厚度。
表1 湖羊基础日粮组成及营养组成(以干物质为基础)Table 1 Formula and nutritional composition of the basal diet in Hu sheep(based on dried matter) %
1.6 睾丸组织转录组的测序分析
1.6.1 文库构建及测序采用Trizol法提取湖羊睾丸组织总RNA,通过Agilent 2100 Bioanalyzer(RNA Nano 6000 Assay Kit,Agilent Technologies,USA)检测RNA完整性。每只个体的总RNA单独建库,文库检测合格后,按照有效浓度及目标下机数据量的需求,对不同文库使用Illumina NovaSeq 6000平台Iillumina,USA)测序。
1.6.2 数据质控与序列对比测序获得的原始数据去除带接头、含N和低质量reads后,对clean data进行Q20、Q30和GC含量等计算及后续分析。从基因组网站(http://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/ovis_aries/)下载绵羊参考基因组和基因模型注释文件(http://ftp.ensembl.org/pub/release-99/gtf/ovis_aries/)。使用HISAT2 v2.0.5构建参考基因组的索引,并将配对末端clean reads与参照基因组比对。
1.6.3 基因表达水平定量根据基因的长度计算每个基因的FPKM(每百万碱基对测序的转录本序列片段的每千碱基片段的预期数量)并计算映射到该基因的读数。
1.6.4 差异表达分析使用DESeq2软件(1.20.0)进行2个比较组合基因之间的差异表达分析。使用Benjamini & Hochberg方法调整P值以控制错误发现率,差异表达分析使用edgeR(3.22.5)软件包进行。将校正后的P值以及差异表达倍数(fold change)作为显著差异表达的阈值。
1.6.5 差异基因的富集分析修正了基因长度偏差后,通过clusterProfiler 3.4.4软件实现差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路富集分析。
1.7 差异基因的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证
选取的差异基因根据序列特异性设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。睾丸组织总RNA提取、反转录和qPCR按Vazyme Biotechw 公司的试剂盒说明书和仪器说明进行操作。qPCR所用引物见表2。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。
1.8 数据分析
表2 RT-qPCR所用引物Table 2 Primers used for real time quantitative PCR analysis
2.1 夏季日粮添加酵母硒对湖羊血液指标的影响
如表3所示:Se组游离脂肪酸的浓度显著高于对照(Con)组(P<0.05);而2组间的葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白浓度无显著差异(P>0.05)。Se组血清GSH-Px活性极显著高于Con组(P<0.01),而SOD活性在2组间无显著差异(P>0.05)。Se组血浆中IgA、IgG和IgM水平极显著高于Con组(P<0.01)。
表3 酵母硒对湖羊血液生化、抗氧化和免疫指标的影响Table 3 Effect of selenium yeast on blood biochemical,antioxidant and immune indexes in Hu sheep
图1 酵母硒对湖羊睾丸组织硒浓度(A)和抗氧化酶活性(B)的影响Fig.1 Effect of selenium yeast on selenium concentration(A)and antioxidant enzyme activity(B)in Hu sheep testis 不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different capital letters mean extremely significant differences(P<0.01),different lowercase letters mean significant difference(P<0.05).
2.2 夏季日粮添加酵母硒对湖羊睾丸硒浓度、抗氧化活性和睾丸发育的影响
如图1所示:Se组睾丸组织硒浓度极显著高于Con组(P<0.01),睾丸组织GSH-Px活性显著高于Con组(P<0.05),但SOD在2组间无显著差异(P>0.05)。由表4可知:Se组湖羊平均日增重显著高于对照组(P<0.05),但2组睾丸大小、质量及睾丸系数无显著差异(P>0.05)。Se组的生精上皮厚度极显著大于Con组(P<0.01),曲精细管内径有小于Con组的趋势(P=0.073),而2组间外径无显著差异(P>0.05)。睾丸组织形态学(图2)结果显示:2组曲精细管内都有精子,Se组睾丸组织曲细精管内的空腔状有所缓解,生精细胞增多,排列更加密集有序,且曲精细管间的间质细胞也明显多于对照组。
表4 酵母硒对湖羊体重、睾丸及曲精细管的影响Table 4 Effect of yeast selenium on body weight,testicular parameters and seminiferous tubule in Hu sheep
图2 酵母硒对湖羊睾丸组织形态学的影响Fig.2 Effect of selenium yeast on the morphology in Hu sheep testis
2.3 差异表达基因分析
测序数据用测序错误率分布检查和GC含量指标进行质控。结果表明测序比对结果良好,可用于进一步的差异表达基因分析。计算各样本所有基因的表达值(FPKM)后,通过盒形图展示不同样本基因表达水平的分布情况(图3-a)。本研究使用的差异阈值为padj≤0.05且|log2[Fold change]|≥1。通过筛选,2组之间鉴定到2 321个差异转录本。其中,与Con组比较,Se组表达上调的差异转录本有671个,表达下调的差异转录本有1 650个(图3-b)。聚类分析后发现,2组间出现分离,同组的不同生物学重复聚集在一起,表明组内的相关性良好(图3-c)。
图3 转录组测序数据统计及差异基因分析Fig.3 Transcriptome sequencing data statistics and differential gene analysis a. 样本基因表达量分布盒形图;b. 差异基因火山图;c. 差异表达基因聚类热图。a. Box plot of sample gene expression distribution;b. Volcano plot of differential genes;c. Heatmap plot of differential genes.
GO(gene ontology)是描述基因功能的综合性数据库,可分为生物过程、细胞组成和分子功能3个部分。GO功能富集以padj<0.01作为显著性富集的阈值,富集结果如图4-a所示。其中生物过程中显著性富集的功能类只有电子转移链;细胞组成中基因功能富集极显著前10位的主要有呼吸链复合体、呼吸链、线粒体膜部分等;分子功能中极显著性富集的功能类有NADH脱氢酶(泛醌)活性和NADH脱氢酶(醌)活性。
2.4 差异表达基因富集的KEGG通路
从KEGG富集结果中,选取最显著的20个KEGG通路绘制气泡图(图4-b)。选取padj<0.01作为显著性富集的阈值时,包括帕金森综合征、朊病毒病、氧化磷酸化、亨廷顿舞蹈病、产热等11条功能通路。
图4 差异表达基因GO富集分析柱状图(a)和KEGG富集气泡图(b)Fig.4 Differentially expressed gene GO enrichment analysis histogram(a)and KEGG enrichment bubble chart(b)
2.5 差异表达基因的RT-qPCR验证
为了验证转录组测序结果的准确性,随机挑选6个差异基因,3个基因上调,分别是BIRC3、SLC16A9和LBR;3个下调基因,分别是EMD、HSPB1和PFDN6。qPCR分析结果表明,6个基因在2组个体间表达变化规律与转录组测序结果基本一致(图5),表明本试验利用转录组测序获得的结果是可信的。
图5 差异表达基因的测序分析(a)与RT-qPCR验证(b)Fig.5 Sequencing analysis of differentially expressed genes(a)and RT-qPCR verification(b) *表示与Con组差异显著(P<0.05);**表示与Con组差异极显著(P<0.01)。*means significant difference compared with the Con group(P<0.05);**means extremely significant differences compared with the Con group(P<0.01).
3.1 夏季日粮添加酵母硒对湖羊血液指标的影响
血清生化指标可以反映动物的代谢状态。研究表明,夏季热应激降低羔羊血清葡萄糖、胆固醇和甘油三酯含量[17]及绵羊血浆不饱和脂肪酸的浓度[18]。热应激升高肉鸭低密度脂蛋白的浓度,降低高密度脂蛋白的浓度[19]。日粮添加硒可以缓解动物的热应激。日粮添加1.2 mg·kg-1纳米硒能降低热应激下肉仔鸡总胆固醇和低密度脂蛋白浓度,增加高密度脂蛋白浓度[20],但用5 mg·mL-1硒注射1 mL治疗热应激时,对绵羊血清葡萄糖浓度、胆固醇和不饱和脂肪酸无影响[21]。热应激下绵羊日粮添加酵母硒且其硒浓度为0.8 mg·kg-1时,可增加葡萄糖浓度,但对不饱和脂肪酸无影响[22]。本研究中日粮添加0.4 mg·kg-1的酵母硒(硒浓度为1.2 mg·kg-1)提高了湖羊血清中不饱和脂肪酸的含量,对葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白没有影响,提示酵母硒可以促进湖羊脂肪的动员,且不同动物种类、温度条件和硒的添加量与形式的处理效果不同。
3.2 夏季日粮添加酵母硒对湖羊抗氧化及免疫功能的影响
热应激能通过过量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生来降低抗氧化防御能力而加剧氧化应激[23]。SOD和GSH-Px是清除ROS的抗氧化参数,通常用它们的活性来评估机体的抗氧化能力。本试验中,湖羊血液和睾丸中GSH-Px活性的变化趋势一致,添加酵母硒后GSH-Px活性升高,SOD无显著变化,提示酵母硒可能通过增加湖羊体内的GSH-Px活性而非SOD活性来增强抗氧化状态。研究表明,在受氧化应激的绵羊日粮中添加酵母硒会显著增加血液GSH-Px的活性,而SOD活性无显著变化[24],这与本研究结果一致。本试验中Se组湖羊睾丸中硒的沉积增加,说明酵母硒对湖羊夏季高温的保护作用能够到达睾丸组织,也验证了血液和睾丸中抗氧化酶活性变化一致的结果。IgA、IgG和IgM是血清免疫球蛋白中含量最多且最为重要的3类,其中IgM是个体发育过程中最早合成和分泌的免疫球蛋白,IgA与IgG主要通过早期免疫球蛋白(IgM和IgD)转换,参与体液免疫应答。热应激通过降低动物机体的IgA、IgG和IgM水平来抑制其免疫功能[25],而补充硒可显著提高山羊血清IgA、IgG和IgM水平[26]。本试验结果与之一致,酵母硒可改善湖羊因夏季高温而降低的免疫反应,进而提高生产性能。
3.3 夏季日粮添加酵母硒对湖羊睾丸发育的影响
动物睾丸的质量、大小以及组织形态学反映睾丸发育的情况。大量研究表明热应激会引起小鼠精子密度和质量损伤[9]以及生精过程受损,包括缺少初级精母细胞和成熟精子[27],而热应激日粮添加硒可以缓解因环境温度升高对兔精子质量和繁殖力的负面影响,且添加硒会使生精小管充满精子细胞[13],增加大鼠精子数量和生精上皮厚度[28]。本研究中酵母硒组生精上皮厚度的增加与前人对大鼠的研究结果一致,提示日粮添加酵母硒可能通过促进睾丸生精上皮的发育来缓解夏季高温对湖羊繁殖机能的负面影响。
3.4 夏季日粮添加酵母硒对湖羊睾丸组织差异基因表达的影响
本研究构建了夏季日粮添加Se组和Con组睾丸组织的转录组文库8个,获得了48.88 Gb的过滤数据,分析发现2组差异表达基因2 321个,qPCR分析验证了测序的准确性。Se组上调的671个基因中,差异显著的前20个有注释的基因包括谷氨酸脱羧酶样蛋白1(GADL1)、下丘脑受体2(HCRTR2)、肌球蛋白轻链激酶3(MYLK3)、类固醇羟化酶(CYP7B1)等基因。类固醇羟化酶(CYP7B1)属于细胞色素P450(CYP)家族,定位于内质网的跨膜蛋白上,主要功能是催化胆固醇骨架7位的羟化反应,能产生许多重要的甾类分子,调控生殖发育过程[29-30],CYP7B1形成的类固醇代谢物可能不仅对雌激素信号很重要,而且对雄激素也很重要[31]。下调的1 650个基因中,差异显著的前20个有注释的基因包括前折叠蛋白亚基6(PFDN6)、NADH脱氢酶亚基1(ND1)、细胞色素C氧化酶亚基3(COX3)、热休克蛋白B1(HSPB1)等基因。HSPB1是热休克蛋白家族的一员,主要作为ATP依赖的分子伴侣,具有抗凋亡和抗氧化应激的作用[32-33],当细胞暴露于热休克时,其表达水平会上调[34]。本试验中差异基因CYP7B1在处理组上调,说明酵母硒能够缓解热应激给机体睾丸带来的损伤,改变类固醇合成相关基因的表达;差异基因HSPB1在Se组下调,提示夏季日粮添加酵母硒降低了机体的热应激水平,可能保护睾丸的发育。除此之外,Se组抗氧化相关基因谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)和谷胱甘肽过氧化物酶8(GPX8)也分别上调约1.9倍和1.6倍,这与血液、睾丸组织抗氧化结果一致。
差异显著基因的GO功能富集筛选到氧化还原酶复合物、NADH脱氢酶复合物、NADH脱氢酶(泛醌)活性和NADH脱氢酶(醌)活性等与氧化应激有关的生物学过程、细胞组分和分子结构。其中主要包括NADH脱氢酶1α复合体亚基3(NDUFA3)、NADH脱氢酶1α复合体亚基8(NDUFA8)、NADH脱氢酶(辅酶Q)Fe-S蛋白5(NDUFS5)、NADH脱氢酶亚基3(ND3)等与生成ROS相关的基因[35-36],且这些基因表达均下调,说明夏季日粮添加酵母硒能降低机体氧化应激水平,减轻热应激引起的睾丸损伤。在进一步的KEGG通路富集分析中,筛选出11个差异极显著通路,其中产热通路与本试验相关,该通路富集了40个差异基因,表明夏季日粮添加酵母硒能够影响湖羊睾丸产热相关基因的表达。
综上,夏季日粮添加酵母硒增加了湖羊血清NEFA浓度,提高了血清和睾丸组织中GSH-Px活性以及血浆免疫球蛋白的浓度,提示酵母硒可以促进湖羊的脂质代谢,改善其抗氧化能力和免疫功能。睾丸转录组测序分析筛选了夏季高温下酵母硒影响湖羊睾丸发育的相关基因,为进一步阐明酵母硒缓解夏季高温影响湖羊繁殖性能的分子机制奠定理论基础。
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