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伏威铭，焦博，张雨，陈奕颖，李嗣生，李薇，杨洁，王强*
1(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐，830046)2(中国农业科学院农产品加工研究所，农业农村部农产品加工重点 实验室，北京，100193)3(中国农业科学院生物技术研究所，北京，100081)
植物基发酵乳一般是由发酵坚果、豆类、谷物和果蔬的水提取物、粉末悬浮液或均质浆液制成，在质地、感官以及长期贮存微生物的能力等方面类似于传统发酵乳。目前植物基发酵乳面临的挑战主要是酸奶凝胶质地脆弱以及产品风味不佳[1]。尽管使用稳定剂和香精能在一定程度上解决这些问题，但稳定剂和香精的存在会使消费者降低购买欲望。通过工艺技术提升凝胶强度和风味是目前植物基发酵乳产业亟需解决的问题。
有研究表明核桃蛋白的等电点为4.8[2]，能够在酸性环境下凝胶化，且核桃无豆腥味等不良风味，具备制作植物基发酵乳的潜力与优势。核桃营养价值极高，脂肪含量高达52%～70%，其中大部分为油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸，还含有约24%的蛋白质和12%～16%的碳水化合物[3]。目前已在核桃中检测出包括酚酸、类黄酮、水解和缩合单宁等大约120种酚类化合物[4]，经常食用核桃除了益智健脑、抗衰老外，还可改善人体肝脏及全身的脂质平衡，有助于避免和治疗心脏病、2型糖尿病等慢性疾病。尽管目前核桃类饮品中接受度最高的是核桃露，但作为哈佛医学院推荐食用的12种“超级食品”，核桃和酸奶的“跨界融合”，必然会引起消费者的关注和期待。
烘烤是植物原料常用的热处理方式，核桃、花生等坚果在烘烤后可获得诱人的风味和色泽，LIU等[5]发现(E，E)-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和吡嗪类物质是烤核桃的特征风味物质，赋予其强烈的烘烤香和焦糖香，减少了青草味和生味等令人不悦的气味。然而核桃在烘烤后会对植物基发酵乳的风味产生何种影响还不得而知。此外，强烈的烘烤条件还会改变蛋白质结构和分子间(内)相互作用力，雷勇刚等[6]研究发现，大豆在120 ℃下烘烤30～60 min后制乳发酵，所得发酵乳的流变特性和物理性质均有所下降，但风味显著提升。核桃经烘烤处理后是否会对其发酵乳的物理性质产生不利影响，还需进一步探讨。本研究旨在探寻烘烤处理对植物基核桃发酵乳流变特性和风味的影响，并筛选出适宜的烘烤条件，在保证发酵乳凝胶强度的前提下，使其风味获得极大提升。
1.1 材料与试剂
市售脱衣核桃仁，购于陕西长胜农产品有限公司；
市售直投式发酵剂，科汉森有限公司；
蔗糖、葡萄糖，均为食品级，北京萃锋科技有限公司；
2-辛醇、甲醇，均为分析纯级，美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
R025烤箱，杭州老板电器股份有限公司；
九阳料理机，九阳股份有限公司；
AH-100D纳米均质机，ATS工业系统有限公司；
恒温恒湿培养箱，北京陆希科技有限公司；
TA.XT plus质构仪，英国SMS公司；
DHR-2型流变仪，美国TA公司；
分光测色仪，杭州彩谱科技有限公司；
DFS高分辨率气质联用仪，美国赛默飞公司。
1.3 实验方法
1.3.1 核桃烘烤处理
脱衣核桃仁经分选、除杂后，称取500 g于烤盘中，放入烤箱分别以60、90、120、150 ℃烘烤15 min，得到不同烘烤温度的脱衣核桃仁，并以未烘烤核桃仁为对照。
1.3.2 核桃发酵乳的制备
烘烤和未烘烤的脱衣核桃仁经榨油机压榨，得到蛋白含量为(34.93±0.15)%、脂肪含量为(37.15±0.66)%、灰分含量为(4.62±0.03)%的部分脱脂核桃粉。将部分脱脂核桃粉以料水比1∶8(g∶mL)浸泡在去离子水中，并加入蔗糖(0.6 g/L)和葡萄糖(0.2 g/L)，经料理机磨浆后得到核桃浆。核桃浆经均质机500 bar 均质后得到核桃乳，在80 ℃、15 min灭菌后，按直投式发酵剂说明书用量(0.2 g/kg)进行接种，混匀后在(40±1) ℃下发酵9 h，再经4 ℃后熟24 h后得到核桃发酵乳。分别以RC表示未烘烤原料制作的核桃发酵乳，以R60、R90、R120、R150表示60、90、120、150 ℃烘烤原料制作的核桃发酵乳。
1.3.3 流变学测定
1.3.3.1 表观黏度
参考王强研究团队的方法，并加以修改[7]。将完成后熟的核桃发酵乳顺时针搅打5次，再逆时针搅打5次，使用配备了铝制平板(直径40 mm，1 mm间隙)的DHR-2流变仪测定其表观黏度。控制温度恒定在(25±1) ℃，剪切速率范围为0.1～100 rad/s，以线性取点的方式采集数据，每个样品进行3次重复。
使用Herschel-Bulkley模型对所得数据进行拟合，模型可由公式(1)表示：
τ=τ0+kγn
(1)
式中：τ为剪切应力，Pa；
τ0为屈服应力，Pa；
k为稠度系数，Pa·sn；
γ为剪切速率，s-1；
n为流动特性指数。
1.3.3.2 频率扫描
正式实验前，所有样品在恒定频率1 Hz下进行应变扫描，以确定线性黏弹区。随后控制温度恒定在(25±1) ℃，设置应变振幅为0.1%(线性黏弹区内)，在0.1～10 Hz下进行频率扫描，确定不同酸奶的黏弹特性。每个样品进行2次重复。
1.3.4 质构特性测定
参考YANG等[8]的方法，并加以修改。使用配备了A/BE探头的质构仪对所有样品进行分析，测试条件如下：测前速度1 mm/s，测试速度1 mm/s，测后速度10 mm/s，测试应变为30%，触发力为10 g。采用硬度、稠度和黏聚性对发酵乳的质构特性进行评价。每个样品进行3次重复。
1.3.5 色度测定
使用分光测色仪对不同核桃发酵乳的色泽进行测定，在测色仪上直接读取L*、a*和b*，每个样品进行3次重复。
1.3.6 核桃发酵乳挥发性风味物质顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用检测
固相微萃取条件参考GURKAN等[9]的方法，并加以修改。样品前处理方法：称取2 g核桃发酵乳于 25 mL 顶空瓶中，加入5 μL内标(2-辛醇，819 μg/mL，溶于甲醇)。混匀后在50 ℃下平衡10 min，插入活化后的DVB/CAR WR/PDMS SPME Arrow萃取头，在50 ℃下萃取30 min，萃取完成后于GC进样口解吸5 min。
GC条件参考LAKHLIFI等[10]的方法，并加以修改。选用TG-SMS石英毛细管(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，采用SSL分流进样，分流比10∶1，进样口温度250 ℃，载气为氦气，流量为1.2 mL/min。升温程序：起始温度为40 ℃保持2.5 min，以7 ℃/min升至70 ℃，然后以2 ℃/mL升至120 ℃，保持1 min，最后以20 ℃升至280 ℃并保持5 min。
质谱条件参考刘原野等[11]的方法，并加以修改。采用EI离子化方式，离子源温度为280 ℃，电子能量为70 eV；
扫描范围为35～500m/z。
挥发性风味物质的定性与定量：使用TraceFinder 5.1软件将化合物的解卷积质谱图与现有的商业标准谱图库(NIST2017)中进行检索匹配，根据化合物保留时间计算其保留指数，通过其计算值与数据库中保留时间指数(retention index，RI)相比较，对化合物进行定性。以已知浓度的2-辛醇为内标，以挥发性物质与内标的峰面积比进行定量分析。
1.3.7 挥发性风味物质评价
参考廖林等[12]的方法，根据1.3.6获得的核桃发酵乳中各挥发性风味物质的含量，查阅相应物质在水中的气味阈值，并计算其香气活性值(odorant activity value，OAV),如公式(2)所示：
(2)
式中：Ci为挥发性风味物质含量，μk/kg；
Ti为该物质的气味阈值，mg/kg。当0.1≤OAV≤1时，表明该风味物质只对总体风味起修饰作用；
当OAV≥1时，表明该风味物质为特征风味物质，对总体风味贡献较大。
1.3.8 感官评价
邀请8名感官评价人员(由4名男性和4名女性组成)对发酵核桃乳进行感官评价，核桃发酵乳的感官评价标准在参考RHB 104—2020《发酵乳感官评鉴细则》的基础上进行适当调整，详见表1。
表1 核桃发酵乳的感官评价标准Table 1 The standard of sensory evaluation of walnut fermented milk
1.4 数据处理
使用SPSS Statistics 19对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，使用The Unscrambler X 10.4对数据进行主成分分析，其他数据采用Microsoft Excel 2016进行处理。
2.1 不同烘烤条件对核桃发酵乳流变学的影响
2.1.1 表观黏度
根据前期预实验，发现将核桃原料先烘烤后脱脂的工艺更适合核桃发酵乳产品开发，因此本研究所探讨的问题均基于此工艺展开。表观黏度是影响发酵乳口感的重要指标。如图1所示，所有样品的表观黏度均随剪切速率的增加而减小，说明核桃发酵乳的蛋白网络结构和油滴可随剪切速率的增加发生重排，是一种具有剪切稀化现象的假塑性流体[13]。但不同烘烤温度处理核桃后所得的发酵乳，其表观黏度具有一定差异。由图1可知，核桃经烘烤后可提升发酵乳的表观黏度，且当烘烤温度为90 ℃时，可获得最大的表观黏度。此外，当剪切速率>35 rad/s时，所有样品的表观黏度出现轻微的剪切变稠，这可能是发酵乳中存在较大的聚集体，阻塞在平行板间隙中所致[14]。
采用Herschel-Bulkley模型对核桃发酵乳的流变结果进行拟合，结果如表2所示。所有样品的相关系数R2均>0.995，说明该模型可以很好的拟合核桃发酵乳的流动曲线。τ0与样品抵抗剪切作用的能力相关，而k与样品的黏度相关。由表2可知，当烘烤温度逐渐升高时，核桃发酵乳的τ0和k逐渐增大，在90 ℃时获得最大值，并显著大于其他各组(P<0.05)，表明此时核桃发酵乳黏度最大，且具有良好的抗剪切作用；
当烘烤温度继续升高，τ0和k逐渐降低，且R150组和RC组间无显著性差异(P>0.05)。王强研究团队的研究表明，核桃蛋白的变性温度为(99.48±0.20) ℃，因此在100 ℃以下的低温烘烤过程中，核桃蛋白的变性程度较低，但蛋白质运动逐渐活跃，从而加剧了蛋白之间的相互作用，使得黏度增加[15-16]。当超过核桃蛋白的变性温度后，其表面的疏水区域和内部的疏水键大量暴露，核桃蛋白在疏水力的作用下形成聚集体并逐渐变大，最后形成沉淀。有研究表明，这种聚集体的形成不仅会降低乳液发酵后的凝胶强度和表观黏度，同时也会使发酵乳的颗粒感明显增强[6]。
图1 不同烘烤条件下核桃发酵乳的表观黏度Fig.1 Apparent viscosity of walnut fermented milk with different roasting conditions
表2 不同烘烤条件下核桃发酵乳的流变参数Table 2 Rheological parameters of walnut fermented milk with different roasting conditions
2.1.2 频率扫描
由图2可知，在0.1～10 Hz的频率范围内，所有样品均表现出频率依赖性，表明不同烘烤条件下的核桃发酵乳均形成了不稳定的弱凝胶，且样品的储能模量(G′)>损耗模量(G″),弹性成分占优势，具有类固体特征[17]。此外，当扫描频率>6 Hz时，所有样品的G′增长速率变大，可能是由于此时发酵乳中的液滴相互接近，形成了更强的网络结构，因此其类固体特性更加明显。
图2 不同烘烤条件下核桃发酵乳的频率扫描曲线Fig.2 Frequency scanning curve of walnut fermented milk with different roasting treatment
此外，烘烤处理也改变了发酵乳凝胶的动态剪切特性，随着烘烤温度增加至90 ℃，样品在同一扫描频率下的G′和G″逐渐增大，说明较低温度(≤90 ℃)的烘烤有助于增强发酵乳凝胶结构。核桃作为一种富含糖、蛋白和油脂的原料，在烘烤过程中往往伴随着美拉德反应的发生，有研究表明美拉德反应可使蛋白质发生共价交联，增加蛋白质长链疏水性基团的含量，增强疏水相互作用，从而提升凝胶黏弹性[18]。除美拉德反应外，蛋白质凝胶强度的改变也可能与蛋白变性程度相关，LI等[19]发现随着蛋白质变性程度的增加，大豆蛋白的游离巯基和二级结构含量减少，三级结构展开，其凝胶强度在网络结构的重排和氢键的形成过程中逐渐增强，但当变性程度过高时(变性程度>86.11%)，由于蛋白质的聚集比去折叠更慢，导致其凝胶结构更加粗糙和不均匀，因此在较高的变性程度下，凝胶强度反而下降。在本实验中，R90组的频率扫描曲线均高于其他各组，表明核桃经90 ℃烘烤15 min后制作的发酵乳获得了最强的凝胶结构。R120组和R150组的频率扫描曲线又逐渐降低可能是由于较为剧烈的烘烤使核桃蛋白的变性程度加深，从而形成蛋白聚集体，在制乳后也更易形成不溶性沉淀，这些沉淀不利于蛋白分子间相互作用形成胶体分子团，因而在微生物发酵产酸后，形成的水合蛋白质网络及凝胶结构也较弱[20]。RC组和R60组的G′在扫描频率较高时增幅更为明显，可能是由于90 ℃以上的烘烤降低了发酵乳凝胶的频率敏感性(图2)。
2.2 不同烘烤条件对核桃发酵乳质构特性和色度的影响
由表3可知，随着烘烤温度升高，核桃发酵乳的硬度、稠度和黏聚性的绝对值逐渐增大，当烘烤温度为90 ℃时，其质构特性值达到最大值，且显著高于其他各组(P<0.05)。之后，随烘烤温度的升高，核桃发酵乳的质构特性值逐渐降低，但始终高于RC组。结合频率扫描(图2)的结果可知，R90组的凝胶结构更均匀、强度更大，并赋予了发酵乳更强的质构特性。
表3 不同烘烤条件下核桃发酵乳的质构特性Table 3 Textural properties of walnut fermented milk with different roasting conditions
由表4可知，随着烘烤温度升高，核桃发酵乳的L*值呈现出先增大后减小的趋势，并在R90组获得最大值，且各组间存在显著性差异(P<0.05)。这可能与此时核桃发酵乳的凝胶结构更加致密、均匀，从而使光线在发酵乳胶体表面形成了更多反射有关，这一结果与HERNANDEZ等[21]的结论一致。此外，过高的烘烤温度会导致美拉德褐变产物剧增，这些着色物质也会使核桃原料颜色加深[22]进而影响核桃发酵乳的色泽。因此随着烘烤温度持续升高，核桃发酵乳的a*值和b*值显著增大(P<0.05)，肉眼观查到发酵乳颜色逐渐变黄变暗。
表4 不同烘烤条件下核桃发酵乳的色度Table 4 Chromaticity of walnut fermented milk with different roasting conditions
2.3 不同烘烤条件对核桃发酵乳风味物质含量的影响
由附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220318.1718.006.html)可知，从5种不同烘烤条件的核桃发酵乳中共鉴定出81种风味化合物，其中烷烃类11种，醛类22种，醚类1种，酯类5种，酮类11种，芳香类10种，醇类8种，酸类4种，呋喃类2种，吡嗪类7种。所有核桃发酵乳中的醛类物质种类最多、含量最高，其次是酮类物质。研究表明，醛类物质具有水果香和油脂香，是核桃油的主要呈香化合物[23]；
其中异戊醛仅存在于高温烘烤的核桃发酵乳中(R120组和R150组)，且大多数的醛类物质，如苯乙醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、3-糠醛和(E,E)-2,4-庚二烯醛等均会随着烘烤温度的升高，含量显著增加(P<0.05)，说明90～150 ℃的烘烤有助于核桃发酵乳油脂香气的提升。而酮类物质具有黄油味和果香味，是发酵乳的主要呈香化合物，其中2,3-戊二酮和3-羟基-2-丁酮具有令人愉悦的黄油味和乳脂味，其含量也随烘烤温度的升高而显著增加(P<0.05)，表现出与酮类物质相似的趋势。
醇类物质是所有核桃发酵乳中含量第三高的化合物，其产生主要与脂肪氧化还原有关[24]，烘烤对脂肪氧化具有一定的促进作用，因此如异丁醇、正己醇、1-辛烯-3-醇和异戊烯醇等醇类化合物含量均随烘烤温度由90 ℃升高至150 ℃而显著增加(P<0.05)，并赋予核桃发酵乳酒香味、果香味和蘑菇味等宜人的风味。呋喃类物质和吡嗪类物质通常由美拉德反应产生，并伴有坚果味和巧克力味，在本实验中，其主要存在于烘烤条件较为剧烈的样品(R150)中。
由于本实验中所检测到的大部分烃类物质、醚类物质、酯类物质、芳香类物质和酸类物质的含量较低，阈值较高；
因此这些化合物对不同烘烤条件下核桃发酵乳的风味贡献度较低(OAV值0～1)，主要起风味修饰作用。
综上所述，核桃发酵乳中的主要风味物质，如醛类、酮类、醇类、呋喃类和吡嗪类物质的含量均会随烘烤温度的升高而增加，表明烘烤有助于核桃发酵乳风味的提升，且当烘烤温度高于90 ℃时这种提升更为明显。
2.4 不同烘烤条件下核桃发酵乳挥发性风味物质的主成分分析
OAV≥1的挥发性风味物质可对总体风味起到较大的贡献，且OAV越大，该物质的贡献越大。由附表1可知，在不同核桃发酵乳中共鉴定出16种OAV ≥1的风味主体物质，其中(E)-2-辛烯醛、(E)-2-壬醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、正己醛、2,4-壬二烯醛、2,3-戊二酮、3-羟基-2-丁酮、正己醇、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃存在于所有处理组中；
正戊醛是R90组和R120组特有的OAV ≥1的物质；
而异戊醛、苯乙醛、2,6-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪是R150组独有的OAV ≥1的物质，以上4种风味化合物具有独特的焦糖香气，这与R150组在剧烈烘烤条件下发生的美拉德反应密切相关。
对16种OAV≥1的主体风味物质进行主成分分析，结果如图3所示。其中主成分-1和主成分-2的方差贡献率分别为70%和28%，累积贡献率为98%(>85%)，即这两个主成分能够反映主体风味物质的整体信息。结合图3-a和图3-b可知，核桃经不同烘烤条件处理后得到的发酵乳风味存在较大差异。R90组和R120组位于x轴上方，其风味与(E)-2-辛烯醛、正戊醛和正己醛有较强的相关性，此时的核桃发酵乳油脂味、发酵味和清新的果香味较为明显；
R150组位于第三象限，其风味与异戊醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,6-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪密切相关，此时的核桃发酵乳具有典型的黄油味、烘烤香和类似巧克力的香味；
RC组和R60组与这16种主体风味物质的相关性不强，因此这两组核桃发酵乳的特征风味不如其他3组明显。综上所述，烘烤条件可对核桃发酵乳的特征风味产生影响，在不同烘烤条件下产生的风味物质能够得到良好的分离。
2.5 不同烘烤条件对核桃发酵乳感官品质的影响
由表5可知，烘烤条件可显著改变核桃发酵乳的感官品质(P<0.05)。就色泽而言，未烘烤的核桃发酵乳颜色呈灰白色，而120 ℃以上的烘烤则赋予核桃发酵乳黄褐色，上述烘烤条件均不能使核桃发酵乳在视觉上引起消费者的购买欲望。就风味而言，120 ℃以上的烘烤能赋予核桃发酵乳明显的油脂香气和烘烤香气，使其在风味方面获得消费者的青睐，然而这种过强的烘烤条件也会使核桃发酵乳的滋味具有明显苦味和糊味，对其感官品质造成负面影响。相较之下，R90组的核桃发酵乳在色泽、滋味和组织状态等方面均能使消费者获得更好的感官体验。感官评价的结果表明，核桃原料经90 ℃ 烘烤15 min后制乳发酵，可极大的提升核桃发酵乳的感官品质。
a-得分图；
b-载荷图 1-异戊醛；
2-苯乙醛、3-(E)-2-辛烯醛；
4-(E)-2-壬醛；
5-(E,E)-2,4-壬二烯醛；
6-(E,E)-2,4-癸二烯醛；
7-2,3-戊二酮；
8-3-羟基-2-丁酮；
9-正己醛；
10-正己醇；
11-1-辛烯-3-醇；
12-2-正戊基呋喃；
13-2,6-二乙基吡嗪；
14-2,3-二乙基-5-甲基吡嗪；
15-2,4-壬二烯醛；
16-正戊醛图3 不同烘烤条件下核桃发酵乳挥发性风味物质的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile flavor compounds in walnut fermented milk with different roasting conditions
表5 不同烘烤条件对核桃发酵乳感官品质的影响Table 5 Effects of different roasting conditions on sensory quality of walnut fermented milk
核桃经烘烤后，其发酵乳的凝胶强度随烘烤温度的升高呈现出先增强、后减弱的趋势，当烘烤温度为90 ℃时，核桃发酵乳的凝胶强度最大，表观黏度、G′和G″均高于其他各组。这种强凝胶结构也赋予了核桃发酵乳更高的硬度、稠度、黏聚性和亮度。此外，烘烤处理也极大的提升了核桃发酵乳的风味，90 ℃和120 ℃ 的烘烤可产生更多的(E)-2-辛烯醛、正戊醛和正己醛，赋予核桃发酵乳油脂香、发酵香和果香；
150 ℃ 的烘烤则提升了发酵乳中异戊醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、2,6-二乙基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的含量，赋予其黄油香、烘烤香和类似巧克力的香气。然而120 ℃和150 ℃的烘烤会使核桃蛋白发生剧烈变性，导致发酵乳凝胶强度减弱。结合感官评价的结果可知，90 ℃烘烤15 min是制作核桃发酵乳的最佳烘烤条件。本研究探明了烘烤处理对核桃发酵乳流变特性和风味的影响，并筛选出了最佳的烘烤条件，提高了核桃发酵乳的品质，并为其工业化生产提供了理论支持和技术指导。
