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姚智会，韩 拓，范雅洁，巩 红，王丽霞，王怡雯，王聪霞
（西安交通大学第二附属医院心血管病院，陕西西安 710004）
血管钙化是慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）患者常见和严重的并发症，目前国内外缺乏有效治疗方案[1]。CRF 患者的血管钙化发生率显著高于普通人群，54%～100% 的慢性肾衰竭终末期（ESRD）行透析患者存在不同程度的血管钙化[2-3]。本课题组前期的meta 分析也显示，全球范围内有68.5% ESRD 维持性透析患者存在腹主动脉钙化[4]。血管钙化的存在使得血管壁僵硬度增加，顺应度降低，进而导致心血管事件的发生。血管钙化是CRF患者心血管死亡率和全因死亡率增加的独立危险因素。如果能有效抑制血管钙化，则能显著降低CRF患者的死亡率[1]。
镁参与机体的多种生物学过程，如心脏节律、血管收缩和骨代谢等。近年来，有研究发现镁能有效抑制CRF 血管钙化的发生发展[5]。在非糖尿病透析患者中，存在血管钙化的患者与不存在钙化的患者相比，血镁水平显著降低，这表明镁是血管钙化的保护性因素[6]。镁盐分无机镁盐（如硫酸镁，氯化镁）和有机镁盐（如枸橼酸镁，magnesium citrate, MgCit），在生物利用度和胃肠道不良反应等方面，有机镁盐比无机镁盐的优势更明显[7]。然而，检索国内外文献发现，关于镁抑制CRF 血管钙化的细胞和动物实验都采用无机镁，有机镁是否也能抑制细胞和动物血管钙化，未见相关研究。前期，本课题组利用CRF 血管钙化大鼠模型，首次阐明MgCit 在体内发挥抑制CRF 血管钙化的作用[8]。本研究利用高磷诱导大鼠血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）钙化，探索MgCit 在VSMCs 钙化中的作用，并初步探索其机制。
1.1 主要试剂
β-甘油磷酸（β-glycerophosphate, β-GP）、NPS-2143（钙敏感受体抑制剂）购自上海源叶公司，钙检测试剂盒购自南京建成公司，Alizarin 染液购自西安赫特公司，碱性磷酸酶试剂盒购自碧云天生物科技公司，RNAiso Plus、逆转录试剂盒、荧光定量PCR 反应试剂盒购自TaKaRa 公司，核心转录因子（runt-related transcription factor 2, RUNX2）、骨形态蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）和平滑肌22α（smooth muscle 22 α,SM22α）的引物购自TaKaRa 公司，α-SMA和BMP2 一 抗 均 购 自ProteinTech，Runx2 一 抗 购 自Abcam 公司。
1.2 VSMCs 钙化模型和分组
实验所用大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7r5（货号：CL-0316）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。用含有50 g/mL 胎牛血清、10 g/mL 青-链霉素混合液、10 mmol/L β-GP 的DMEM 溶液培养VSMCs，定期更换新的培养基，培养14 d 诱导VSMCs 钙化。细胞分为①对照组：普通培养基；
②钙化组：含10 mmol/L β-GP；
③1.5 mmol/L MgCit 组：含10 mmol/L β-GP和1.5 mmol/L MgCit；
④3 mmol/L MgCit 组：含10 mmol/L β-GP 和3 mmol/L MgCit；
⑤MgCit+NPS2143 组：含10 mmol/L β-GP、3 mmol/L MgCit和15 μmol/L NPS2143。
1.3 茜素红染色
在盖玻片上培养VSMCs，14 d 后弃去培养基，加入40 g/L 多聚甲醛固定10 min，PBS 洗涤后加入茜素红染液，适当孵育后PBS 冲洗；
玻片在丙酮溶液中蘸20 下，在二甲苯与丙酮混合液中蘸20 下，在纯二甲苯溶液中静置5 min，封片，显微镜下观察和拍照；
Image J 软件半定量分析橙红色颗粒样物质。
1.4 胞内钙含量检测
弃去培养板中细胞培养液，PBS 清洗后用2.5 g/L胰酶消化细胞并将细胞分成两份：一份利用BCA 法检测蛋白浓度，另一份在细胞沉淀中加入0.6 mol/L的稀盐酸溶解细胞内羟基磷灰石结晶（4 ℃，24 h）。根据钙检测试剂盒说明书，用甲基麝香草酚蓝络合法测定盐酸溶液提取物中的钙含量；
最终钙浓度用蛋白含量标化。
1.5 碱性磷酸酶（ALP）活性检测
用不含碱性磷酸酶的RIPA 裂解液在冰上裂解细胞，收集细胞裂解液，4 ℃、12 000 g 离心10 min，取上清液，分成两部分，一部分用BCA 法检测蛋白浓度；
另一部分按照碱性磷酸酶试剂盒说明书操作，即加入样品和标准，混匀，37 ℃孵育15 min，每孔加入100 μL反应终止液，检测吸光度A 值，用血管中的总蛋白含量标准化ALP 活性。
1.6 qRT-PCR 检测VSMCs 成骨样转分化相关蛋白的mRNA 表达
按照RNAiso Plus 试剂盒的步骤提取细胞总RNA；
用NanoDrop 检测提取RNA 的浓度和纯度；
按照逆转录试剂盒的步骤进行逆转录反应，获得cDNA；
根据荧光PCR 试剂盒说明书进行荧光定量PCR 反应；
以β-actin 为内参，计算目的基因mRNA 的相对表达水平。本研究所用到的引物序列见表1。
表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences
1.7 免疫组化检测VSMCs 成骨样转分化相关蛋白表达
细胞培养结束后，弃去孔板中细胞培养上清液，PBS 清洗后40 g/L 多聚甲醛室温固定10 min，PBS清洗；
用含Triton X-100 的PBS 溶液透膜20 min（膜表达抗原BMP2 省略该步骤，核表达抗原RUNX2 包含此步骤），PBS 清洗；
用50 g/L BSA 溶液室温封闭20 min，弃去液但不洗，用含一抗的孵育液在4 ℃孵育12～16 h。第2 天用PBS 清洗，按照二抗试剂盒说明书依次加入后续反应液；
滴加DAB 显色液，孵育5 min；
苏木素染核30 s，蒸馏水清洗，后续常规脱水、透明并用中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。
1.8 Western blotting 检测VSMCs 成骨样转分化相关蛋白表达
在6 孔板中培养各组细胞，干预结束后，每孔加入含1 mmol/L PMSF 的RIPA 蛋白裂解液，吹打均匀后收集裂解液至EP 管中，冰上裂解30 min，期间要上下颠倒EP 管，使之充分裂解；
提前预冷离心机，4 ℃、12 000 g 离心20 min，取上清至新的EP 管中；
加入loading buffer 后在100 ℃水浴中加热5 min，取含有40 μg 总蛋白的样品电泳；
将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜，用50 g/L 脱脂牛奶封闭2 h；
一抗（α-SMA，1∶1 000；
Runx2，1∶300；
GAPDH，1∶2 000）孵育过夜；
室温孵育二抗（1∶1 000）40 min 至1 h，ECL 显色和拍照。利用Image J 软件对目的条带和GAPDH 的灰度值进行统计分析。
1.9 统计学分析
所有实验数据用均数±标准差表示，用Graph-Pad Prism(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)软件进行统计分析。多组间数据比较用One-way ANOVA（≥3 组）统计方法，非配对两组间数据比较用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 MgCit 降低高磷诱导的VSMCs 钙化
采 用10 mmol/L β-GP 诱 导VSMCs 钙 化，利 用茜素红染色半定量各组细胞的钙含量。结果显示：与对照组相比，细胞钙化模型组中钙含量明显增加（P＜0.000 1），表现为大量橙红色物质沉积明显升高；
与细胞钙化模型组相比，MgCit 干预组的钙含量明显降低（P=0.001 5），且高剂量MgCit 组的钙含量明显低于低剂量MgCit组（P=0.000 4，图1）。
图1 MgCit 对高磷诱导的VSMCs 钙化影响Fig.1 The effects of MgCit on hyperphosphorus-induced VSMCs calcification
2.2 MgCit 抑制高磷诱导的VSMCs 成骨样转分化
高磷环境下，VSMCs 钙化过程中伴随成骨样转分化，包括RUNX2和BMP2表达降低，以及SM22α表达下降。本研究发现：与对照组相比，高磷模型组细胞发生成骨样转分化，包括BMP2 和RUNX2 的mRNA 和 蛋 白 表 达 升 高、SM22α 的mRNA 表 达 升高。与高磷模型组相比，MgCit 干预组的成骨样转分化水平降低（图2）。
2.3 MgCit 激活CaSR 抑制高磷诱导的VSMCs 钙化和成骨样转分化
镁是钙敏感受体（calcium sensing receptor,CaSR）激动剂。而研究表明，激活CaSR 能抑制CRF 血管钙化[9]。在本部分研究中，我们初步探索MgCit抑制高磷诱导VSMCs钙化的机制。结果表明：MgCit能抑制高磷诱导的VSMCs成骨样转分化和钙化，但当同时给予CaSR 抑制剂时，MgCit抑制高磷诱导的VSMCs钙化和成骨样转分化的作用被部分抑制。与MgCit干预组相比，MgCit+NPS2143组的细胞钙含量（392vs.513 μg/mg蛋白）、ALP活性（193.5vs.258.2 U/mg蛋白）明显增加（P＜0.001）；
Western blotting 提示，MgCit+NPS2143组的RUNX2蛋白表达量较MgCit干预组明显增加，而α-SMA蛋白表达量明显降低（图3）。
图3 CaSR 抑制剂对MgCit 抑制高磷诱导的VSMCs 钙化和成骨样转分化的影响Fig.3 The effects of CaSR inhibitor on MgCit inhibiting hyperphosphorus-induced osteogenic transdifferentiation and calcification of VSMCs
Control：正常对照；
β-GP：β-甘油磷酸（β-glycerophosphate）；
MgCit：枸橼酸镁（magnesium citrate）。A、B、C：SM22α、BMP2 和RUNX2 的mRNA 表达比较；
D：RUNX2 和BMP2 的免疫组织化学染色结果。与正常对照组（control）比较，aP＜0.05；
与β-GP 组比较，bP＜0.05；
与β-GP+1.5 mmol/L MgCit 组比较，cP＜0.05。
CRF 患者肾小球滤过率下降，导致磷排泄受阻，引起高磷血症。众所周知，高磷是CRF 患者发生血管钙化的独立危险因素，高磷诱导VSMCs 钙化是应用广泛的CRF 钙化模型。高磷能通过直接和间接途径促进血管钙化的发生发展：一方面，磷与钙结合形成羟基磷灰石，当沉积在血管中时，会直接引发血管钙化；
另一方面，高磷通过增加氧化应激和炎症反应，增加促钙化作用因子分泌等作用，间接促进血管钙化的发生发展[10]。血管钙化的存在，使得CRF 患者死亡率显著提高[1]，因此找到有效抑制CRF 血管钙化的新药物至关重要。
基础和临床试验均发现，适当补充镁制剂能抑制CRF 血管钙化。近期一项双盲对照研究以CRF3-4期患者为研究对象，并随机分为对照组和口服氧化镁（magnesium oxide, MgO）组，2 年后评价这些患者冠状动脉钙化（coronary artery calcification, CAC）评分的变化情况，结果显示，与对照组相比，口服MgO 组CAC 积分的变化更低（11.3%vs.39.5%），并且在CAC 积分变化≥15%的人群中，对照组占62%，而口服MgO 组只占23.9%，表明镁在抑制CAC 进展中有重要作用[11]。RUNX2 是VSMCs 成骨样转分化指标，CRF 环境下，VSMCs 存在成骨样转分化，即RUNX2表达升高，而α-SMA 表达下降。基础实验中，用含腺嘌呤和高磷的饲料饲养大鼠诱导CRF 血管钙化模型，同时给予高镁饮食的大鼠主动脉钙化水平显著低于CRF 血管钙化模型组大鼠；
同时，高镁饮食组的RUNX2 水平低于钙化模型组，而α-SMA 水平高于钙化模型组，这表明镁通过抑制高磷诱导VSMCs 成骨样转分化抑制CRF 大鼠血管钙化[8]。补充含镁制剂不仅能抑制CRF 相关血管钙化，还能抑制非CRF相关的血管钙化。例如，Abcc6 基因突变会导致弹性纤维假黄瘤，该疾病存在全身广泛异位钙化，以Abcc6 基因缺失小鼠制备血管钙化模型，发现补充含镁制剂能明显降低小鼠血管钙化水平[12]；
DBA/2 小鼠常因营养不良发生心肌钙化，可能与该品系小鼠血浆镁水平低有关系，给该品系小鼠增加饮食中的镁盐后，可以降低心脏钙含量，在一定程度上抑制心肌钙化[13]。
CaSR 是G 蛋白耦联受体C 家族成员，在骨和矿物质代谢中发挥关键作用。近年来，CaSR 在心血管疾病中的作用逐渐引起关注。CaSR 激活能抑制CRF 血管钙化，而镁是CaSR 的激动剂，活化CaSR能抑制血管钙化，因此镁可能通过激活CaSR 发挥抑制血管钙化的作用[9]。
本研究通过高磷诱导VSMCs 钙化模型，给予MgCit 干预，证明MgCit 能抑制高磷诱导的VSMCs成骨样转分化和钙化。当给予CaSR 抑制剂后，MgCit 抑制高磷诱导VSMCs 钙化和成骨样转分化的能力降低，这表明MgCit 可能通过激活CaSR 发挥抑制高磷诱导VSMCs 钙化的作用。本研究利用MgCit干预高磷诱导VSMCs，并对其机制进行初步探索，对探索抑制CRF 血管钙化的新药物具有重要意义。当然，本研究也存在一定的局限性：①本研究利用高磷诱导VSMCs 钙化，模拟CRF 血管钙化模型展开研究，而CRF 血管钙化是多种因素共同作用的结果，利用CRF 患者血清进行模型诱导可能更符合生理状态；
②本研究只构建VSMCs 钙化模型，缺少动物模型，利用动物模型进行体内实验更加能说明问题；
③本研究利用NPS2143——一种CaSR 抑制剂，对CaSR 蛋白表达进行干预，证明镁通过激活CaSR 抑制血管钙化，后续我们将构建CaSR siRNA，从基因水平干预CaSR，进一步证明镁抑制血管钙化的机制。
