【www.zhangdahai.com--其他范文】
李晓敏，唐毓婧，贾轶静，李长金，李 杰，郭子芳
（中国石化 北京化工研究院，北京 100013）
一次性生物反应系统是生物制药领域生产疫苗、单克隆抗体、重组药物蛋白等生物产品的重要设备，主要是由美国食品药品监督管理局认证的塑料材料（聚乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、乙烯乙烯醇等）制成的一种即装即用、不可重复利用的培养器［1］。20 世纪开始应用［2-3］。1963 年，一种由聚丙烯和聚四氟乙烯制成的一次性摇晃四面体袋成功应用在枯草芽孢杆菌等细胞的培养上［4］。随后一次性中空纤维膜生物反应器［5-7］、细胞工厂［8-10］及两室透析膜生物反应器［11-12］在动物细胞培养领域占据了主要地位。在此阶段，也有少量研究描述了波浪混合对微生物和细胞在袋体中培养的适用性［13-14］。20 世纪末，Wave Biotech 公司成功开发出波浪混合式一次性生物反应器，并推出了第一台用于商业化生产的WAVE Bioreactor 20 反应器，标志着一次性生物反应系统的大规模应用［15-16］。该系统应用广泛，市场前景良好。
一次性生物反应系统专用膜是一次性生物反应器的主要部分，专用膜是一种聚合物单层或多层薄膜，在使用过程中通常一面直接与培养液体接触，另一面与外界接触，具有良好的气体阻隔功能，可为细胞生长提供环境保障［2］。以目前应用较多、典型的5 层结构为例，专有膜主要分为外层、内层、中间阻隔层及两层中间黏结层。外层通常由强度高、韧性好、耐穿刺、耐折叠的材料制成，保障内部细胞或微生物的培养。内层为液体接触层，直接和细胞、微生物、培养基等物料接触，需要具备较低的可提取物或浸出物，满足细胞的正常生长和代谢，为细胞培养营造适宜的环境。阻隔层在中间，提供气体阻隔性能，为细胞生长提供环境保障。黏结层的作用是将上述三层结构黏结在一起，保障膜体结构完整且反应液体不泄露。
本文对一次性生物反应系统专用复合膜的发展历程、组成结构、使用原料及制造工艺进行介绍，综述了目前主要专用膜产品及相关评价指标，并对一次性生物反应系统专用复合膜的未来发展进行了展望。
一次性生物反应系统专用膜所用原料均为热塑性聚合物材料，具有共同的性质，可通过加热使其变为黏稠液体，便于后期加工成膜。单层专用膜的主聚合物通常只有一种，并辅以相应的添加剂，多层专用膜各层功能不同，对聚合物的要求也不同，因此需根据不同层的性能需求选择合适的聚合物。聚合物的性质主要和分子量及其分布、共聚单体种类和含量有关，并决定着聚合物最终的行为方式。
1.1 内层
专用膜内层为液体接触层，与培养液体直接接触，材料主要具备以下功能：1）较好的柔韧性、抗撕裂性、耐穿刺性，保证在使用过程中的可靠性。2）低可提取物/浸出物，能满足细胞的正常生长和代谢，为细胞生长营造适宜的环境，有较好的生物相容性，适于细胞培养。3）热封性：液体接触层需具备足够的热封强度，能为生物反应器袋体加工提供热合焊接功能，避免在使用时出现液体渗漏［2］。可用作接触层的材料类型有线型低密度聚乙烯（LLDPE）、超低密度聚乙烯（ULDPE）、低密度聚乙烯（LDPE）共聚物或混合物、乙烯-醋酸乙烯共聚物（EVA）等。LLDPE 以良好的机械性能闻名，如撕裂强度、抗穿刺性、拉伸性、强度和韧性等，且在柔韧性、密封能力和韧性之间提供了非常好的平衡，这些特性使它成为膜内层材料的良好候选材料之一。ULDPE 既具有 LLDPE 的高强度，又具有较高的热封强度。EVA（醋酸乙烯酯含量为4%～18%（w））与 LDPE 非常相似，具有高支化度，可形成硬度低、韧性高、熔体温度低、柔韧性高和透明度高的低结晶材料，可作为内层接触材料使用。
1.2 阻隔层
阻隔层用原料通常为乙烯乙烯醇共聚物（EVOH）。使用EVOH 的主要原因是EVOH 可以提供气体阻隔性［17］。EVOH 材料中乙烯的含量（24%～48%（x））越低，阻隔性能越高。且EVOH 对湿度敏感，吸收水分会降低阻隔性能，因此EVOH 应作为中间层嵌入提供防潮功能的两层中。另外，聚酰胺（PA）也称尼龙，具有较高的柔韧性和略逊于EVOH 的气体阻隔性能，由于EVOH 耐水性和耐弯折性较差，因此国内也有一些研究者提出EVOH 和尼龙的两层或三层复合结构作为阻隔层使用［18-19］。聚偏二氯乙烯具有非常好的水蒸气阻隔性能，也有望替代 EVOH用作阻隔层。
1.3 外层
专用膜外层用原料通常为聚乙烯系列、EVA、PA、聚酯等聚合物材料，与内层较为相似。外层材料具有的主要性能是焊接操作的热稳定性和良好的机械性能（高强度、柔韧性、抗穿刺等）。因为一次性生物反应系统的容积决定了生产效率，大型反应器需要配备大容积工艺袋，专用膜材料需要具备足够的强度，焊接结构需要足够的可靠性，需要经受较大的使用压力及工艺袋在制作、折叠包装、运输、展开安装和正常使用过程中可能产生的各种弯折和可能的损伤。聚乙烯系列和EVA 的性质能够符合外层的需求。PA 能够用于专用膜的主要原因是稳定性和优异的机械性能，如拉伸强度、抗穿刺性。另外，聚酯类，聚对苯二甲酸乙二醇酯由于优异的耐热性和机械性能，也常用于专用膜外层。
1.4 黏结层
黏结层的主要特性是将阻隔层连接到内外层，因此需采用具有黏结作用的聚合物原料，通常可用作黏结层的材料类型为酸酐改性聚烯烃或酸改性聚烯烃，如马来酸酐接枝的乙烯/丁烯（己烯、辛烯）共聚物。
从原料到多层复合膜材料需要一定的制造工艺来实现，通常为薄膜挤出工艺［20-21］。在多层聚合物原料复合过程中，除原料外，各层添加物和膜的厚度也需要重点关注。在制造过程中添加一种或多种添加剂，主要是为了使薄膜更好地复合在一起，或者不易氧化、胶黏等。同时，总体膜的厚度及各层的厚度也有一定的要求，需满足各层膜和整体的性能指标。
2.1 专用膜生产工艺
在专用膜的工业化生产中，吹塑、流延、挤出层压等薄膜挤出工艺是最常用的工艺技术［2］。基本过程是将经选料得到的各层原料组分分别加入到多层共挤吹膜机（流延机等）对应的进料通道中，在特定机头温度条件下，经熔融、吹塑或流延共挤出、挤出再涂布等，通过调整相应工艺参数得到特定厚度的多层共挤出一次性生物反应系统专用膜。多层共挤出吹塑是多层聚合物复合膜材料的一种成型方法，它可以将两种以上的聚合物，使用两台以上的挤出机，分别熔融后经过各自独立的流道，进入多层口模共同挤出具有多层结构的“膜管”，并成型为多层结构的聚合物复合膜材料。通过流延方法制备的聚合物薄膜，是先经过挤出机把原料塑化熔融，再通过T 形结构成型模具挤出，聚合物熔体呈片状流延至平稳旋转的冷却辊筒表面上，膜片在冷却辊筒上经冷却降温定型，再经牵引、切边后收卷。挤出涂布是先挤出两层或多层膜，然后在表面涂布一层聚合物。应根据多层膜结构设计、原料等选择合适的工艺进行膜的制备。值得注意的是，完整的吹膜、流延膜或涂布过程一般都在洁净室中进行，以保证不受外部污染。
另外，在膜制造过程中，各层结构中通常需添加一种或多种添加剂。如添加抗氧化剂三（2，4-二叔丁基苯基）亚磷酸酯（抗氧剂168）、3-（3，5-二叔丁基-4-羟苯基）丙酸十八烷酯（抗氧剂1076）、四［β-（3，5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸］季戊四醇酯（抗氧剂1010）、丁基羟基甲苯等。又如在外层添加防黏结的二氧化硅、硅酸镁、碳酸钙、硬脂酸钙、硅氧烷等。但一般内层需与细胞介质接触，接触层则不应包含滑爽剂或邻苯二甲酸酯为增塑剂，因为这些添加剂可能包括能够迁移至内层表面的小分子物质，进而污染细胞。
2.2 专用膜厚度
一次性生物反应系统专用膜的总厚度和每一层的厚度，都需要认真选定。每层的厚度选择决定着专用膜的强度、韧性、气体阻隔性、稳定性等。专用膜总厚度一般在200 ～500 μm，目前市场上的专用膜产品通常为350 μm 左右。其中，作为与细胞接触的液体接触层和最外层的防护层相对较厚，以保证膜材的强度、韧性、热合强度，通常外层厚度在50 ～150 μm，内层厚度在150 ～300 μm；
阻隔层厚度达到相应的气体透过率要求即可，厚度适中，通常在15 ～50 μm。黏合层需提供黏合作用，通常厚度为5 ～50 μm。
3.1 国内外专用膜产品
专用膜材料一般是直接制成一次性生物反应袋、搅拌袋、储液袋等出售，单独出售膜产品的较少。目前，膜产品主要由国外几家公司生产并制成相应的下游产品出售。主要有德国雷诺丽特公司、赛多利斯公司、美国赛默飞世尔科技公司、密理博公司、通用公司及颇尔公司。目前，膜产品多为5 层结构，内层使用聚乙烯系列产品居多，尤其是ULDPE，阻隔层几乎全部采用EVOH，外层的选择比较多样，聚乙烯系列、聚酯系列都是常见的选择，见表1。
表1 国外主要一次性生物反应系统专用膜产品及组成结构Table 1 Main foreign film products and structures for disposable bioprocessing systems
国内能够进行膜制品及袋体生产的公司较少，且原料和膜材料主要依赖进口。2022 年初，上海乐纯生物技术有限公司推出了LeKrius 生物工艺薄膜（ULDPE/tie/EVOH/tie/LDPE），并实现了量产，有望缓解一次性生物反应系统原材料紧张、成本高昂等问题。浙江金仪盛世生物工程有限公司、上海东富龙科技股份有限公司、楚天科技股份有限公司等也对膜材料，配液袋、储液袋等袋体，一次性生物反应器等开展了相关工作［18-19，22-23］。
3.2 专用膜性能评价
多层结构专用膜的性能评价主要包括四个方面：机械性能、物理性能、稳定性及生物安全性。由于专用膜的特殊使用环境，需要膜材料具备优异的强度、柔韧性、耐刮擦、耐穿刺、热封性等机械性能。同时，在长时间细胞培养和运输过程中，需严格控制膜材内外部的气体交换、监测膜内液体情况，因此，膜的气体阻隔性和透明性也是必须考察的重要因素。另外，膜的稳定性和生物安全性是工业化应用的必要前提。只有综合考虑这些性能，才使膜更具有实用性。
3.2.1 机械性能
机械性能（强度和韧性、热封性、耐穿刺性、抗疲劳性等）是专用膜重要的技术指标，是膜材料能够用于一次性生物反应系统的重要前提。专用膜强度和韧性是最先考察的一个要素，通常通过拉伸强度及伸长率、断裂强度和伸长率、弹性模量等测试来判断，同时，膜材料制备为袋体时，需进行热封，因此一定的热合强度也是材料的必备性能。为使袋体内部液体不易泄漏，材料必须是耐穿刺的。并且制成的袋体可能用于搅拌系统，长时间的搅拌对材料的性能要求较高，除了强度和韧性外，抗疲劳性也是材料应用的前提。
3.2.2 物理性能
一次性生物反应袋、储液袋等需严格控制袋体内部和外部的气体交换，尤其是氧气、水蒸气和二氧化碳，因此专用膜需具备良好的气体阻隔性能。专用膜的氧气透过量一般必须小于9.9 mL/（m2·d·MPa）。同理，一般二氧化碳和水蒸气的透过量也需处于较低水平，才被认为具有良好的阻隔性能。此外，透明性也是专用膜的一个重要考察指标。膜材需具有良好的透明性（透光率大于等于75%），才有利于操作人员观察袋体内部情况，以便对反应进程、液体存储情况进行监测。
3.2.3 稳定性
专用膜存在与袋体内部溶液相互作用的潜在风险，因此膜自身稳定性是质量保障的前提。稳定性主要包括热稳定性、耐酸碱能力，冻存/解冻稳定性以及辐照稳定性。以辐照稳定性为例，γ 射线辐照可能增加聚合物内部的交联或添加剂的降解［24］，而专用膜在使用前均需通过γ 射线辐照进行无菌处理。因此考察辐照后专用膜是否发生变化是判断材料辐照稳定性的重要方式。
从专用膜的制备过程可知，专用膜并非纯化合物。除了基础聚合物，中间可能还需加入抗氧化剂、抗黏结剂等改善聚合物的加工性能或增强最终的使用性能。因此，专用膜上还可能存在一些不良残留物，比如未反应的单体、过程中使用的溶剂、聚合催化剂、表面活性剂或聚合物降解产物，可能对细胞产生毒性作用，影响材料的生物相容性。据报道膜材料中常见的溶出物抗氧化剂分解产物双（2，4-二叔丁基苯基）磷酸酯仅百万分之几的含量就会对细胞生长产生有害影响［25-28］。对膜供应商而言，可提取物和可浸出物的测定是工艺验证的重要部分，是必须提供的产品参数。目前，除《美国药典》中有制药包装/运输体系相关可提取物测试方法外，也有部分针对一次性系统中可提取物和溶出物测试方法的研究［29-32］。
3.2.4 生物安全性
专用膜主要用于抗体、重组蛋白等生产过程，产品与人民的生命健康息息相关，因此必须保障专用膜的生物安全性。专用膜的生物安全性主要分为体外生物安全性和体内生物安全性，体外生物安全性验证最常用的是体外细胞毒性实验，测试方法参考《美国药典》中的方法。另外，溶血实验和细菌内毒素检查法也常用来判断专用膜与血液的相互作用以及细菌内毒素是否符合规定。体内的生物安全性主要是参考塑料的体内生物反应性，通过全身注射实验、皮下注射实验以及植入实验检测动物对专有膜的生物反应性，测试方法参考《美国药典》中的方法。一般国外制造商生产的专用膜产品均为最为严格的Ⅳ级，因此这类专用膜产品被认为具备良好的生物相容性。当然，也可采用标准GB/T 16886.5―2017［33］，GB/T 16886.6―2015［34］，GB/T 16886.10―2017［35］，GB/T 16886.11―2011［36］对 一次性生物反应专用膜、反应袋或储液袋等制品的生物安全性进行相关评价。
随着一次性生物反应系统规模的扩大，袋体容量也在扩大，商业化应用最大规模一般为2 000 L，如何平衡袋体容量规模和专用膜性能之间的关系，使其能够更好地用于一次性生物反应系统，是后续主要的研发方向。专用膜溶出物和析出物带来的问题不可忽视，对聚合物也有一定的要求，寻求安全性和稳定性更高的聚合物进行专用膜复合是后续需要解决的重要问题。一次性生物反应系统除了用于抗体和重组蛋白的生产外，也逐步扩展到微生物发酵、藻类培养、食品和化妆品生产等，需设计更符合实际应用场景需求的专用膜结构。
猜你喜欢 内层外层专用 一种溶液探测传感器传感器世界(2022年4期)2022-11-24沁人心脾的“香”阅读(低年级)(2022年5期)2022-06-03悬浮花盆学苑创造·B版(2019年2期)2019-02-19德里女性专用车厢受青睐阅读与作文（英语初中版）(2018年8期)2018-12-27复合函数求单调区间的数形结合方法课程教育研究(2017年28期)2017-08-29一种购物袋科技资讯(2016年6期)2016-05-14Otterbox Samsung防御者系列三星GS6专用保护壳三联生活周刊(2015年26期)2015-06-26专题Ⅱ 物质构成的奥秘试题与研究·中考化学(2015年1期)2015-06-15数学达人专用时钟数学大王·低年级(2015年3期)2015-04-17飞机是怎么飞上天的？科普童话·百科探秘(2009年6期)2009-07-14本文来源：http://www.zhangdahai.com/shiyongfanwen/qitafanwen/2023/0429/591301.html
