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乔树伟,李保胜,李效宇,王子璇,李碧榕,董 博,孟维艳
（吉林大学口腔医院口腔种植科，吉林 长春 130021）
牙周膜是位于牙骨质与牙槽骨之间的结缔组织，起到连接牙齿与其他牙周组织的重要作用［1］。牙周膜成纤维细胞 （periodontal ligament fibroblasts，PDLFs）是牙周膜的主要组成细胞，对于调节炎症及维持牙周组织稳态至关重要［2］。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）是牙周炎的主要致病菌，而其膜表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 是主要的致病因子［3］。当发生牙周炎时，细菌及其产生的毒力因子会导致PDLFs进行性损伤，牙周膜受到破坏［4］；
而PDLFs产生的炎症介质，如肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 6（interleukin-6， IL-6） 和 白 细 胞 介 素 1β（interleukin-1β，IL-1β）会进一步造成牙槽骨吸收，最终牙齿脱落［5-6］。但牙周炎的发病机制目前尚未完全清楚。
溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）是胱氨酸/谷氨酸逆转运体的核心成分，其按1∶1的比例将胞内谷氨酸转运出细胞，同时将细胞外的胱氨酸转运到细胞内，用 于 谷 胱 甘 肽 （glutathione， GSH） 的 合 成［7］。GSH是谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）发挥作用的重要辅助因子，GPX4可以提高细胞的抗氧化能力，降低细胞内活性 氧 （reactive oxygen species， ROS） 水 平［8］。SLC7A11和GPX4在癌症、缺血性器官损伤和退行性疾病等方面起着重要作用，并在铁死亡中扮演重 要 角 色［9-10］。
近 期 有 多 项 研 究［11-13］显 示：SLC7A11和GPX4与各类炎症损伤性疾病有关，如类风湿性关节炎、急性肺损伤和急性肝衰竭。但目前尚未见关于牙周炎与SLC7A11和GPX4关系的报道，因此本研究初步探讨在P.g-LPS刺激的炎症状态下，人牙周膜成纤维细胞（human PDLFs， hPDLFs） 中SLC7A11和GPX4表达的变化，进一步了解P.g-LPS对hPDLFs的影响，并探讨其在诱导炎症方面的机制。
1.1 主要试剂和仪器 P.g-LPS（美国Invivogen公司），DMEM培养液、PBS缓冲液、青霉素链霉素双抗和胰蛋白酶（美国HyClone公司），胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）（以色列BI公司），免疫显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），波形蛋白（Vimentin）抗体和细胞角蛋白14（cytokeratin 14，CK14）抗体（沈阳万类生物科技有限公司），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司），β-actin抗体（美国ProteinTech公司），SLC7A11和GPX4抗体（美国Abcam公司），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′， 6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）（北 京 索莱宝科技有限公司），RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）和ROS检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），ECL化学发光液（苏州新赛美生物科技有限公司）。Vanox倒置显微镜（日本Olympus公司），酶标仪（美国Bio-TEK公司），RT-qPCR仪（美国安捷伦公司），电泳仪（美国赛默飞世尔公司）。
1.2 hPDLFs的分离和培养 于吉林大学口腔医院颌面外科门诊收集8例患者（15～25岁）因正畸或其他原因拔除的健康第三磨牙，患者无牙周炎和吸烟史。用含10%双抗的PBS缓冲液冲洗牙齿50次后，去除牙龈组织，刀片刮取牙根中1/3的牙周膜，修剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小的块状，均匀接种于T25培养瓶中，加入4 mL完全培养基（10%FBS、1%双抗和89%DMEM）后，倒置放入细胞孵育箱。4 h后翻瓶，5 d后观察组织块并换液，之后每2 d换液，直至细胞爬满培养瓶80%面积时传代。第3～6代细胞用于后续实验。本研究经本院伦理委员会批准（伦理审批号：202144），患者知情同意。
1.3 倒置显微镜下观察hPDLFs形态表现和免疫组织化学染色鉴定 倒置显微镜下观察原代和第3代hPDLFs的形态表现。取第3代hPDLFs制成单细胞悬液，接种于细胞爬片上，24 h后PBS缓冲液清洗3次后4%多聚甲醛固定。采用免疫显色试剂盒和DAB显色试剂盒对细胞爬片进行免疫组织化学染色后，镜下观察并拍照。
1.4 细胞分组 取第3～6代hPDLFs接种于6孔细胞培养板，密度为2×105/孔。待细胞长至80%时，弃上清，PBS缓冲液清洗，对照组细胞中加入不含 P.g-LPS（即0 mg·L－1P.g-LPS） 的完全培养基，1和10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中分别加入含 1和10 mg·L－1P.g-LPS的完全培养基。培养24 h后，进行后续实验。
1.5 RT-qPCR法检测各组细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平 Trizol法提取各组细胞的总RNA，测定总RNA浓度后，使用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，采用RT-qPCR法检测各组细胞中SLC7A11、GPX4、TNF-α、IL-6和 IL-1β mRNA表达水平。以 β-actin为内参，反应条件：95℃预变性5 min；
95℃变性10 s，60℃退火/延伸30 s，循环数为40次。采用2－△△Ct法计算目的基因mRNA表达水平。引物序列如下：TNF-α，上游引物 5′-CTGCCTGCTGCACTTTGGAG-3′， 下 游 引 物 5′-ACATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3′；
IL-6， 上 游 引 物 5′-AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA-3′， 下 游 引 物5′-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC-3′；
IL-1β，上游引物 5′-CAGCAGCATCTCGACAAGAG-3′，下游 引 物 5′-CATCATCCCACGAGTCACAG-3′；
SLC7A11， 上 游 引 物 5′-GGTACTGCAATCACAATGCCAGA-3′， 下 游 引 物 5′-GCACATGCATCAAGAGTTTCCATAA-3′；
GPX4， 上 游 引 物5′-AAGGACCTGCCCCACTATTTC-3′， 下 游 引物 5′-ACGCTGGATTTTCGGGTCT-3′；
β-actin，上 游 引 物 5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′， 下 游 引 物 5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。
1.6 Western blotting法检测各组细胞中SLC7A11和GPX4蛋白表达水平 弃去各组细胞的上清液，冰上用预冷的PBS缓冲液冲洗1次后加入RIPA裂解液，充分裂解后提取蛋白并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，尽快进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，并与SLC7A11、GPX4和 β-actin一抗 （1∶1 000） 4 ℃孵育过夜。第2天，洗膜3次后，室温摇床孵育二抗1 h。洗膜3次后使用ECL化学发光液显影。采用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.7 2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）荧光探针法检测各组细胞中ROS水平 细胞经P.g-LPS刺激24 h后，弃去上清液，PBS缓冲液冲洗，用10 mg·L－1的 DAPI室温染色 10 min。PBS 缓冲液洗净 DAPI染液后， 加入 10 μmol·L－1DCFH-DA 37℃避光孵育40 min。用不含血清的DMEM洗涤3次，去除未进入细胞的DCFH-DA，在荧光显微镜下观察并拍照记录。采用Image J软件对荧光强度进行分析，计算ROS水平。DCFH-DA荧光强度/DAPI荧光强度代表ROS水平，结果以相对于对照组的倍数表示。
1.8 统计学分析 采用GraghPad Prism 8.0统计软件进行统计学分析。各组细胞中炎症因子、SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平，各组细胞中SLC7A11和GPX4蛋白表达水平，各组细胞中ROS水平，均符合正态分布，以±s表示。多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 hPDLFs形态表现和鉴定 倒置显微镜下观察，5～8 d有条索状细胞从组织块边缘爬出，12 d可见大量成纤维细胞围绕组织块呈放射状生长（图1A）；
第3代细胞有较强增殖能力，且呈漩涡状生长（图1B），细胞为长梭形或多边形，单核，核圆形或卵圆形（图1C），符合hPDLFs形态学特征。免疫组织化学染色结果：Vimentin蛋白染色阳性（图2A），胞质呈棕黄色；
CK14蛋白染色阴性（图2B），证明其来源于中胚层，而非上皮细胞，提取的细胞为hPDLFs，可用于后续实验。
图1 倒置显微镜下hPDLFs的形态表现Fig.1 Morphological performance of hPDLFs under inverted microscope
图2 Vimentin和CK14蛋白在hPDLFs中的表达情况（免疫组织化学，×100）Fig.2 Expressions of Vimentin and CK14 proteins in hPDLFs（Immunohistochemistry, ×100）
2.2 各组细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平 与对照组比较，经P.g-LPS刺激24 h后，1和 10 mg·L－1P.g-LPS 组细胞中 TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05）；
与 1 mg·L－1P.g-LPS组比较，10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中上述炎症因子mRNA表达水平明显升高（P ＜0.05）。见图3。
图3 各组hPDLFs中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平Fig.3 Expression levels of TNF-α,IL-6 and IL-1β mRNA in hPDLFs in various groups
2.3 各组细胞中SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平 与对照组比较，1和10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）；
与 1 mg·L－1P.g-LPS组 比 较，10 mg·L－1P.g-LPS 组细胞中 SLC7A11和 GPX4 mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05）。见图4。
图4 各组hPDLFs中SLC7A11和GPX4 mRNA表达水平Fig.4 Expression levels of SLC7A11 and GPX4 mRNA in hPDLFs in various groups
2.4 各组细胞中SLC7A11和GPX4蛋白表达水平 与对照组比较，1和10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中SLC7A11和GPX4蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；
与 1 mg·L－1P.g-LPS 组 比 较，10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中SLC7A11和GPX4蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图5。
图5 各组hPDLFs中SLC7A11和GPX4蛋白表达电泳图（A）和直条图（B，C）Fig.5 Electrophoregram(A)and histogram(B,C)of expressions of SLC7A11 and GPX4 proteins in hPDLFs in various groups
2.5 各组细胞中ROS水平 不同浓度P.g-LPS分别作用hPDLFs 24 h后，采用DAPI和DCFH-DA荧光探针分别将细胞核和细胞内的ROS染色，DAPI染色为蓝色，DCFH-DA染色为绿色。与对照组比较，1和10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中ROS水平明显升高 （P＜0.05）；
与1 mg·L－1P.g-LPS组比较，10 mg·L－1P.g-LPS组细胞中ROS水平明显升高（P＜0.05）。见图6。
图6 DAPI和DCFH-DA荧光探针检测各组hPDLFs中ROS水平Fig.6 ROS levels in hPDLFs in various groups detected by DAPI and DCFH-DA fluorescence probe
本研究通过免疫组织化学染色证明所分离的细胞为hPDLFs。作为体外探索牙周炎发病机制的模型细胞［14-15］，hPDLFs在P.g-LPS刺激的炎症状态下SLC7A11和GPX4表达下降，为进一步阐释P.g-LPS对hPDLFs的影响并探讨其在诱导炎症方面的机制提供了实验依据。
SLC7A11和GPX4与炎症的发生发展有密切关联。研究［16］显示：小鼠小胶质细胞BV2处于炎症状态时，SLC7A11和GPX4蛋白表达水平降低。另有研究［12］显示：在大肠杆菌LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中，小鼠肺组织中SLC7A11和GPX4表达水平降低。人支气管上皮细胞和滑膜细胞经大肠杆菌LPS刺激后，SLC7A11和GPX4表达均下调［11-12］。GPX4作为SLC7A11的下游蛋白，不仅可以减少过氧化氢（H2O2）和一般的小氢过氧化物，甚至还可以减少生物膜和脂蛋白中的氢过氧化物［17］。目前关于SLC7A11和GPX4与炎症关系的探索主要集中在大肠杆菌LPS的研究，未见关于P.g-LPS及其在牙周炎中作用的相关报道。P.g-LPS的致病特性由脂质A决定，也正是因为P.g-LPS的脂质A结构与大肠杆菌LPS的不同，使两者的作用效果存在差异，因此P.g-LPS对牙周炎发生发展过程中SLC7A11和GPX4的影响尚未明确［18］。本文作者采用P.g-LPS刺激hPDLFs 24 h后，观察到细胞中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平随着P.g-LPS浓度的升高而逐渐升高，但SLC7A11和GPX4表达水平却逐渐降低，在一定程度上证明本研究P.g-LPS诱导的炎症状态与hPDLFs中SLC7A11和GPX4的下调有密切关联。
为了进一步了解SLC7A11和GPX4与牙周炎的关系，本研究检测了hPDLFs中ROS水平，结果显示：随着P.g-LPS浓度升高，hPDLFs中ROS水平逐渐升高，可能是由于GPX4的下调使得毒性脂质过氧化氢被还原成无毒脂醇的能力下降，从而促 进 了 ROS 产 生［17，19］。
研 究［20-21］显 示：
过 量 的ROS一方面可以通过诱导PDLFs中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的激活，引发IL-1β成熟；
另外还能通过介导磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶标（mammalian target of rapamycin，mTOR） 信号通路使TNF-α和IL-6表达水平升高，从而加重炎症。在本研究中，P.g-LPS可以导致hPDLFs中ROS水平升高，同时TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平与ROS水平呈正相关关系，与以往的研究［20-21］结论相符合。因此，本文作者推测：P.g-LPS可能通过下调SLC7A11和GPX4表达，加剧ROS产生，导致炎症因子高表达，从而加重牙周炎。
综上所述，本研究结果证实在P.g-LPS刺激的炎症环境中，hPDLFs中SLC7A11和GPX4表达水平降低，提示SLC7A11和GPX4与牙周炎的发病机制有密切关联。本研究结果为牙周炎发病机制的研究提供了理论依据，为牙周炎治疗和预防提供了一个新的视角。
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