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洪昕 高铭舒 许小君 魏元元 李小磊 黄启超
作者单位：710000 西安 空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室；
710000 西安 西北大学生命科学学院；
710000 西安 陕西中医药大学第二临床医学院；
250000 济南 中国人民解放军第960医院
流行病学和分子学研究表明，肝癌的发展是一个多步骤、多因素的过程，其发病分子机制至今仍不清楚［1］。因此，建立肝癌动物模型是探索肝癌发病机制、筛选鉴定潜在药物靶点、开展临床前研究的必要途径之一［2］。小鼠因具有与人类基因组高度相似、繁殖能力强、模型构建成本低、易于基因操作等优势而被认为是研究肿瘤最理想的模式动物之一［3］。近年来已有多种小鼠肝癌模型应用于基础研究，如基因工程小鼠模型、化学诱导模型和人类肝癌组织/细胞的异种移植模型［4］，但这些模型都仍存在一定局限性［5］，如基因工程小鼠研究成本昂贵，且研究周期较长；
化学诱导的小鼠肝癌DNA突变情况不明确；
异种移植小鼠由于免疫缺陷，其肿瘤微环境与人体肿瘤微环境差异较大。相比传统的小鼠肝癌造模方式，基于高压水动力注射基因转染法具有以下优势［5］：⑴高压注射转染法仅将目的基因传递入少量肝细胞中表达，而周围是众多正常细胞，因而可更好地模拟人体中肝癌的发生过程；
⑵采用6～8周的成年小鼠进行造模，可避免基因转染表达过程对小鼠胚胎发育的影响；
⑶该法可以在注射后的几周内迅速在不同种系背景的小鼠中成瘤，避免了构建基因工程小鼠的高昂成本，大幅降低了所需的小鼠数量，并显著加快实验进度、节省了科研经费和时间；
⑷可同时转入多个癌基因诱导肝癌发生，更好地模拟了人肿瘤发生过程中的多基因突变。此外，该法还具有造模成功率高，小鼠意外死亡率低等优点。总体而言，高压水动力尾静脉注射基因转染法是一种可靠的、快速的、灵活的和节约成本的构建小鼠肝癌模型方法，近年来越来越受研究者的重视［5］。本文就基于高压水动力注射基因转染法构建小鼠原发性肝癌模型的方法及其研究进展进行概述。
1.1 利用高压水动力法在肝脏转染基因的基本原理
高压水动力转染法于1999年由美国匹斯堡大学华人科学家刘德喜教授开发，主要用于向小鼠肝脏细胞进行基因表达及靶向治疗［6］。该法在极短时间内（7s左右）通过尾静脉注射2 mL含有目的基因质粒的等渗生理溶液（相当于体重10%），大体积的质粒溶液可导致短暂性心功能障碍和下腔静脉积液，巨大的水压也使注入的溶液逆行进入肝脏（图1），同时进一步借助压力穿透毛细血管壁，并在血管周围的肝实质细胞膜打孔，使目的质粒进入肝细胞并表达［7］。成功注射后，在透射电子显微镜下可以在肝细胞中观察到大量囊泡结构（图2）［8］。此外，高压的水动力注射可能导致短暂的肝损伤，但1周左右可自行修复［9］。免疫组化显示，经高压水动力成功注射质粒8 h后，10%～40%的肝细胞被转染并表达目的质粒，而其他器官如肾脏、肺、心脏等的转染效率远低于肝脏，说明该转染技术具有良好的特异性［6］。研究还显示，与中央静脉相邻区域的肝细胞最容易被转染，这一区域通常可以观察到表达目的基因的异质细胞群（图3）［10］。
图1 高压水动力注射基因转染路线示意图
图2 正常及高压水动力注射基因转染后的小鼠肝脏超微结构［8］
图3 组织学评价高压水动力注射基因转染对肝脏的影响（甲苯胺蓝染色）[10]
1.2 高压水动力注射基因转染与睡美人转座子系统结合
值得注意的是，高压水动力转染的质粒会在肝细胞内被快速降解，导致质粒表达十分短暂，在24 h内达到峰值后急剧下降，1周后甚至下降约1 000倍［6，11］。为了克服这一难题，研究者将高压水动力转染技术与DNA重组技术如睡美人（sleeping beauty，SB）转座子系统相结合，实现了在肝细胞中基因组整合的持续表达［12］。SB转座子系统由两个质粒组成：一个质粒编码SB转座酶（SB10），另一个质粒两侧为可被转座酶识别的反向重复序列（ITR），并可在两个序列间插入拟表达的目的基因（图4A）。将两个质粒以1∶10～1∶25的比例混合后通过高压水动力注射的方法注入小鼠尾静脉，SB10转座酶表达后可识别ITR序列，并将其包含的目的DNA序列插入肝细胞基因组任意包含A：T/T：A二核苷酸序列的位置（图4B），一旦癌基因在肝细胞中稳定表达，即可最终诱导小鼠肝癌的形成［5，13］。值得一提的是，2005年YANT等［14］报道了另一个版本的SB转座酶SB13，该转座酶是SB10的突变体（T83和K33A），其活性较SB10显著增强。
图4 SB转座子系统组成（A）及技术原理（B）［13］
1.3 高压水动力转染与PiggyBac转座子系统结合
尽管SB转座子实现了目的基因的持续表达，但其携带长DNA片段的能力有限，随着转座子长度的增加，转座效率显著降低，因此其在小鼠遗传学中的应用受到限制［15］。例如，在HeLa细胞中，SB转座子中携带的外源基因每增加1 kb，转座效率约降低30%［16］。为了解决上述问题，2005年许田教授课题组开发了一种新的转座子系统（即PiggyBac，PB转座子）并在Cell杂志上报道［15］。该系统可携带超过100 kb大小的外源基因，且在携带9.1 kb外源序列时并未发现其整合效率显著降低［15，17］。通过利用高压水动力转染与PB转座子系统结合，2022年浙江大学赵斌教授团队在NatureCommunications杂志上报道了线粒体蛋白FUNDC2通过介导肝癌细胞线粒体片段化促进肝癌发生及进展的机制［18］。同年，该团队再次在Scienceadvances杂志上报道了其构建的二十余种小鼠原发性肝癌模型，系统描述了各模型的病理类型、成瘤时间、小鼠生存期等，并开展了转录组与蛋白组学分析，为进一步利用此类模型研究肝癌发生机制，探寻药物靶点等奠定了理论基础［19］。
近年来研究者基于高压水动力注射基因转染法，通过利用单基因、多基因共转染等方式，同时结合shRNA沉默技术、CRISPR/Cas9系统或转基因技术已经成功建立了多种不同表型的肝癌模型（表1）［19-52］，如肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）模型、肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）模型、肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）模型、纤维板层肝细胞癌（fibrolamellar hepatocellular carcinoma，FL-HCC）模型、脂肪性肝炎肝细胞癌（steatohepatitic hepatocellular carcinoma，SH-HCC）模型以及兼具HCC和ICC成分的混合型肝癌（combined hepatocellularcholangiocarcinoma，cHC）模型等。
表1 高压水动力注射基因转染法构建的小鼠原发性肝癌模型
2.1 单个原癌基因的高压水动力转染
PI3K/AKT/mTOR信号通路是调控细胞周期、增殖、凋亡和代谢的重要信号通路，其上调激活在人类HCC中经常发生并伴不良预后［53］。2011年，加州大学陈欣教授团队通过高压水动力学转染方式对野生型FVB/N小鼠尾静脉注射活化型AKT，结果可导致肝细胞增殖，增加肝脏异常脂肪合成，进而导致肝硬化，最终在注射后6个月发生HCC［22］。更重要的是，转染的AKT仅在相对较少的肝细胞中表达，且这些细胞被未转染的肝细胞包围，形成有限数量的病灶［12］。这种表达模式与人类肝癌更类似，也模拟了现实中异常单细胞的肿瘤起源［54］。同样，作为一种特征明确的致癌基因，c-Myc参与了细胞生长、增殖和分化等细胞活动，在人类HCC和HB中经常被观察到过度表达［55-56］。2012年，陈欣教授团队在Hepatology杂志上报道，应用高压水动力学转染将c-Myc基因转染至小鼠肝脏后5～8周可形成肝脏肿瘤［25］。组织学评价显示转染的肝细胞由小而具有高增殖能力的肿瘤细胞组成，这与人类HB高度相似［5］。
2.2 多个原癌基因的高压水动力转染
流行病学和分子学研究表明，HCC的发生与发展是一个多步骤的、复杂的过程，需要多种信号通路的激活［1］。在大多数情况下，HCC的发生并非由单个基因突变导致，通过高压水动力转染单个原癌基因在短时间内尚难以促进小鼠HCC形成。随着单基因转染局限性逐渐被认识，多个原癌基因的高压水动力转染新模式逐渐被开发。其中，典型的例子是Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路被认为参与调节人类胚胎发育、细胞增殖和分化等［57］。在15%～30%的HCC中，Wnt/β-catenin信号通路过度激活并最终促进HCC的发生与进展［57］。然而，通过高压水动力转染过表达ΔN90-β-catenin（活化型β-catenin），1年后仍未能诱导HCC的形成［27］。与之类似，通过高压水动力转染单纯过表达NRasG12V并不能促进小鼠HCC的形成，但是通过高压水动力共转染活化型β-catenin与NRasG12V却能在3个月内成功构建小鼠HCC模型［28］。这提示了HCC发生的复杂性，也为利用高压水动力转染技术研究不同致癌基因复杂的互作关系提供了理想的动物模型。基于此，多种原癌基因组合诱导小鼠肝癌发生的研究模式逐渐被研究者采用。例如，鉴于NRasG12V在小鼠肝脏中的活化与促增殖PI3K/AKT信号通路的过度激活有关［49］。2012年陈欣教授团队对野生型小鼠高压水动力共转染活化型AKT和NRasG12V质粒，以观察其协同作用，结果发现该法不仅可使小鼠的成瘤时间缩短，而且还发生了罕见的混合型肝癌［35］。此外，陈欣教授团队［22］采用活化型AKT/β-catenin组合并通过高压水动力转染，同样发现野生型小鼠能在1个月内发生HCC。
ICC是发病率仅次于HCC的肝脏原发恶性肿瘤，恶性程度高，预后不佳。目前ICC的发病机制仍不明确，且长期缺乏用于研究的动物模型。近年来，高压水动力注射基因转染法为构建ICC动物模型带来曙光，也为进一步理解ICC的发生提供有力的研究手段。2012年，陈欣教授团队应用高压水动力转染法在野生型小鼠肝脏中过表达活化型Notch（NICD），5个月后成功诱导ICC发生，而且AKT和NICD共表达可加速ICC发生，经过3周潜伏期即可形成ICC［23］。此外，该团队还利用该小鼠模型进行肝细胞命运追踪，发现共转染NICD与AKT后激活的NOTCH和AKT信号可协同将正常肝细胞转化为胆管细胞，表明ICC可通过转分化起源于成熟肝细胞，打破了既往ICC仅能起源于二级胆管及其分支上皮的观点［23］。2017年，YAMAMOTO等［36］采用活化型AKT、YAP、c-Myc三种原癌基因组合进行高压水动力共转染，6周后，活化型AKT/YAP组合在野生型C57BL/6J小鼠体内成功诱导出ICC。2019年，陈欣教授团队再次首次报道FBXW7基因在人ICC标本中表达降低，并通过高压水动力共转染活化型AKT与Fbxw7ΔF（Fbxw7的突变体），结果于6周左右成功建立了ICC小鼠模型［41］。
2.3 基于shRNA的高压水动力转染沉默技术
目前的高压水动力转染研究大多集中于致癌基因的过表达，但事实上众多抑癌基因的失活也在肝癌发生中发挥重要作用，因此应用高压水动力转染shRNA成为了可行的方法。目前，大多数研究者采用shRNA高压水动力转染沉默技术与高压水动力转染原癌基因相结合的方式构建HCC小鼠模型。迄今为止，基于shRNA的高压水动力转染沉默实验应用较广泛是抑癌基因TP53（小鼠为Trp53）［5］。2011 年 STAUFFER等［37］报道了高压水动力转染HRasG12V结合Trp53的转染沉默实验，发现小鼠在4周内发生HCC。2017年MOON等［43］采用高压水动力共转染原癌基因Smad7和HRasG12V并结合shp53沉默实验，也发现野生型C57BL/6小鼠5周内出现HCC。然而值得注意的是，也有研究发现高压转染注射19 mer茎环结构的shRNA对肝细胞具有毒性，但机制尚不清楚［5，58］。这些因素使基于shRNA的高压水动力转染沉默技术更具挑战性。
2.4 基于CRISPR/Cas9的高压水动力转染敲除技术
为了克服SB转座子系统可能使目的基因整合在染色体的多个位置这一缺陷，2014年XUE等［59］首次利用高压水动力转染CRISPR/Cas9系统介导PTEN、Trp53单独或同时敲除，结果发现在注射后3个月，所有PTEN和Trp53双敲除的小鼠均发生HCC。该研究证明了利用高压水动力转染结合CRISPR/Cas9系统在肝脏中直接突变抑癌基因的可行性，为研究遗传改变在肝癌发生中的作用及肝癌的功能基因组学提供了新的途径。此外，2017年ENGELHOLM等［21］还试图利用高压水动力转染CRISPR/Cas9系统研究DNAJB1和PRKACA致癌基因融合在纤维板层肝细胞癌中的作用。该研究针对鼠DNAJB1和PRKACA的内含子设计了诱导DNA双链切割断裂的引导RNA，随后的DNA修复导致DNA末端连接，从而创造了DNAJB1-PRKACA基因融合。该研究还发现肝脏中有这种基因融合的小鼠产生了与人类纤维板层肝细胞癌许多相似的特征。
2.5 高压水动力转染结合基因编辑小鼠模型的构建
高压水动力转染技术的另一个主要优势是可以联合使用转基因或基因敲除小鼠，从而研究肝癌发生过程中不同表达变化基因的协同作用和机制［5］。例如2022年本课题组［26］探索了c-Myc促进HB恶性转化和进展的潜在机制，通过高压水动力转染技术在肝特异性敲除线粒体融合分子MFN1的小鼠中过表达c-Myc，阐述了线粒体碎片化促进c-Myc依赖HB的作用机制。此外本课题组［38］在肝特异性敲除TFAM的小鼠，中通过高压水动力共转染活化型AKT/β-catenin或AKT/NRas诱导肝脏肿瘤发生，发现肝特异性敲除TFAM的小鼠分别在6周和4周后发生了肺转移。这一研究首次建立了一种有效、快速、重复性极好的小鼠自发肝癌转移模型，为后续癌症转移的机制研究奠定了基础。
基于高压水动力注射基因转染法构建小鼠原发性肝癌模型的方法越来越受到肝癌研究领域科学家的关注。该模型与shRNA的高压水动力转染沉默技术、传统基因敲除技术、CRISPR/Cas9基因编辑技术相结合，极大地扩展了其在肝癌研究中的应用，是一种可供今后科研和临床药物研究使用的理想的肝癌动物模型。但是目前大部分研究集中在探索肿瘤的发生，有关肿瘤转移和肿瘤消退的小鼠模型研究仍较少。将来可继续利用高压水动力注射基因转染法，探索并构建新的小鼠原发性肝癌模型，以研究肝癌的转移、复发等机制。此外，高压水动力转染法还可进一步联合其他造模方法，以应用于脂肪肝、肝纤维化或肝硬化背景，从而更好地反映人类原发性肝癌发生的自然进程。
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