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王晓伟 李正日 金 花 贾寓洁 赵景华 赵 健 黄 旭 吴成哲
干眼是最常见的眼表疾病之一，被认为是一种多因素疾病，虽然其发病机制尚未确定，但越来越多的证据表明眼表炎症在干眼的发生和发展过程中可能起关键作用[1-4]。
相关研究已确定核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NLRs)是一种炎症和炎症后续免疫反应的关键介质。在NLRs中，核苷酸结合寡聚化结构域样受体1(Nod-1)和受体2(Nod-2)在受到特征微生物产物和危险信号等刺激后激活核因子kappa B(NF-κB)免疫通路，诱导促炎介质转录的上调，进而激活促炎反应[5]。已有研究表明，在干眼患者眼表中，同为NLRs家族成员的NLR pyrin结构域3(NLRP3)炎症小体的mRNA和蛋白质表达均上调，这提示NLRP3炎症小体参与了炎症性干眼的发生和发展[6-7]。但是，目前有关Nod-1受体蛋白是否也参与干眼的炎症发生研究尚少。因此，本研究的目的是通过研究干眼患者Nod-1受体蛋白与眼表参数的相关性，明确Nod-1受体蛋白是否与干眼的炎症发展有关。
1.1 一般资料选取2021年1月至6月就诊于延边大学附属医院眼科门诊的受试者50例(右眼)，其中干眼患者27眼(男11眼、女16眼)为干眼组，非干眼的健康人23眼(男13眼、女10眼)为对照组。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经我院医学伦理委员会审批，所有受试者及家属均签署知情同意书。所有受试者年龄均为18～70岁。干眼诊断标准参考《中国干眼专家共识：检查和诊断(2020版)》[8]：(1)具有干涩感、眼疲劳、视力波动、异物感等主观症状；
(2)泪膜破裂时间(BUT)≤5 s或泪液分泌实验(SⅠT)≤5 mm;(3)BUT为>5～≤10 s或SⅠT为>5～10 mm，并伴有角膜荧光素染色(FL)阳性。符合(1)+(2)或(1)+(3)项即可诊断。
排除标准：(1)年龄<18岁或>70岁；
(2)严重全身疾病，如痴呆、脑梗死、干燥综合征、Stevens-Johnson综合征等；
(3)近4周使用过全身抗生素或眼部滴眼液;(4)1个月内配戴角结膜接触镜；
(5)3个月内眼部手术史，如白内障、近视、翼状胬肉手术等；
(6)眼部外伤或化学烧伤史；
(7)感染性角膜结膜炎、急性泪囊炎、泪点阻塞、急性青光眼等其他眼部疾病。
1.2 评估指标评估指标包括眼表疾病指数(OSDI)评分、FL评分、BUT、SⅠT、泪液中蛋白质检测和炎症因子检测，并按此顺序对每位受试者进行检测。
1.2.1 OSDI评分OSDI问卷用于量化详细的干眼状评分，包括以下子量表：(1)眼部症状(OSDI症状)；
(2)日常生活中的视觉相关活动(OSDI视觉功能)；
(3)环境触发因素(OSDI触发因素)[9-10]。通过这项问卷调查，分析受试者OSDI总分，分值范围为0～100分。
1.2.2 FL评分用1滴奥布卡因滴眼液湿润荧光素钠眼科检测试纸(天津晶明新技术开发有限公司)，放置在受检者下穹隆处，叮嘱患者数次眨眼后平视前方，用钴蓝光16倍镜下观察患者全角膜染色情况。评分标准：采用 0～12 分制记录染色结果，即将角膜划分为4个象限，每一象限根据染色程度和面积评 0～3 分，其中，0分为无染色，1分为轻度染色和少量散乱的斑点，2分为在1～3分之间的中度染色，3分为严重的染色和汇合的染色或角膜细丝。
1.2.3 BUT嘱患者瞬目3～5次后平视前方，用钴蓝光在16倍镜下观察患者末次瞬目至第一次出现泪膜破裂点的时间，重复检查3次，取平均值进行分析。
1.2.4 SⅠT将校准的泪液检测滤纸条(天津晶明新技术开发有限公司)置入患者下结膜囊的中外1/3交界处，嘱患者向下看或轻轻闭眼，5 min后取出滤纸，测量滤纸湿润长度，连续测量3次取平均值。
1.2.5 蛋白质和炎症因子检测用毛细管收集患者20 μL非刺激性泪液，用ELISA检测泪液中Nod-1受体、NF-κB p65和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达水平。向预先包被抗体的酶标孔中加入样本，再加入辣根过氧化物酶标记的识别抗原，37 ℃下孵育1 h，两者与固相抗原竞争结合形成免疫复合物，经加入Tween-20的磷酸缓冲液洗涤后，结合的辣根过氧化物酶催化四甲基联苯胺成蓝色，随后在酸的作用下转化变成黄色，在450 nm波长下的吸光度与样本中抗原的浓度成负相关[11]。
1.3 统计学方法使用SPSS 24.0和Excel进行统计分析，除性别外，所有数据均符合连续变量的正态分布，且采用Shapiro-Wilk检验进行评估，数据用均数±标准差表示。两组受试者年龄、眼表参数、泪液中蛋白质和炎症因子比较行两独立样本t检验，受试者性别进行Mann-WhitneyU检验。采用Pearson相关系数分析Nod-1受体蛋白、NF-κB p65蛋白、IL-1β水平与眼表参数的相关性。检验水准：α=0.05。
2.1 两组受试者一般资料本研究共纳入50名受试者。干眼组和对照组受试者的OSDI评分、BUT、SⅠT、FL评分组间差异均有统计学意义(均为P<0.001)；
两组受试者年龄、性别差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1)。
表1 两组受试者一般资料
2.2 受试者泪液中蛋白质和炎症因子表达水平干眼组患者泪液中Nod-1受体蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β表达水平均显著高于对照组，差异均有统计学意义(均为P<0.001)(表2)。
表2 两组受试者泪液中蛋白质炎症因子表达水平
2.3 干眼组患者泪液中蛋白质和炎症因子表达与眼表参数的相关性
2.3.1 Nod-1受体蛋白表达与眼表参数的相关性干眼组患者中，Nod-1受体蛋白的表达水平与 OSDI 评分、FL评分均呈强正相关性，与SⅠT呈强负相关性(rOSDI=0.669，rFL=0.643，rSⅠT=-0.661；
POSDI<0.001，PFL=0.002，PSⅠT<0.001)，与BUT无显著相关性(r=-0.002，P=0.991)(图1)。
图1 干眼组患者泪液中Nod-1受体蛋白表达与眼表参数之间的相关性
2.3.2 NF-κB p65蛋白表达与眼表参数的相关性在干眼组患者中，NF-κB p65蛋白的表达水平与OSDI评分、FL评分均呈中等强度正相关性，与SⅠT呈中等强度负相关性，差异均有统计学意义(rOSDI=0.482，rFL=0.599，rSⅠT=-0.452；
PDSDI=0.011，PFL=0.010，PSⅠT=0.018)，与BUT无显著相关性(r=0.101，P=0.617)(图2)。
图2 干眼组患者泪液中NF-κB p65蛋白表达与眼表参数之间的相关性
2.3.3 IL-1β表达与眼表参数的相关性干眼组患者中，IL-1β的表达水平与OSDI评分和FL评分均呈强正相关性(rOSDI=0.713，rFL=0.472；
POSDI<0.001，PFL=0.013)，与SⅠT呈中等强度负相关性(r=-0.614，P=0.010)，与BUT无显著相关性(r=0.153，P=0.446)(图3)。
图3 干眼组患者泪液中IL-1β表达与眼表参数之间的相关性
眼表炎症现在被认为是诱导干眼发生的主要因素。已有研究明确，在干眼患者的眼表中可以观察到许多炎症标志物的改变[12-13]。近年来，不断有研究表明先天性免疫和适应性免疫的平衡在干眼发病机制中有非常重要的作用。当受到损伤因子刺激后，在NLRs的作用下，活化的胱天蛋白酶-1(caspase-1)参与到IL-1β的成熟,并启动先天性免疫应答清除病原体[14]。在NLRs中，Nod-1受体蛋白是通过“数量”和“时间”两种因素来促进眼部炎症发生[15]，同样，眼表上皮细胞中的NF-κB也是多种眼表疾病的下游免疫反应的关键调节因子[16-17]，这说明Nod-1受体蛋白和NF-κB都参与了眼部的炎症反应。此外，Li等[18]研究发现，在干眼小鼠模型中，Nod-2受体通过激活小鼠眼表的NF-κB通路诱导炎症发展和细胞凋亡，从而减少小鼠泪液分泌，这表明Nod-2受体相关通路参与了干眼的发展。然而，Nod-1受体蛋白相关的免疫通路是否也参与了干眼的发展现在尚未完全清楚。
本研究旨在通过评估Nod-1受体蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β在干眼患者泪液中的表达，确定Nod-1受体蛋白与干眼患者眼表参数的相关性。本研究结果表明，与对照组相比，干眼组患者泪液中的Nod-1受体蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β表达水平均显著增高，且差异均有统计学意义，这些结果提示Nod-1受体蛋白可能与干眼发生过程中的眼表炎症有关。Niu等[6]研究表明，NLRP3炎症小体及其下游炎症因子Caspase-1、IL-1β、IL-18在干眼患者的泪液和眼表中表达增高，这些发现与本研究结果一致，即在干眼患者眼表中NLRs的表达增加。
本研究结果显示，干眼组患者的OSDI评分和FL评分与Nod-1受体蛋白的表达呈显著的正相关，SⅠT 与Nod-1受体蛋白的表达呈显著负相关，且NF-κB p65蛋白和IL-1β也呈现类似的结果。这表明Nod-1受体蛋白的表达水平与眼部炎症的严重程度和干眼症状的分级有关。此外，本研究结果还表明，干眼组患者Nod-1受体蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β表达水平与BUT之间没有显著相关性。国际泪膜与眼表协会(TFOS)[19]在其报告中阐明，泪膜的不稳定性是影响干眼患者BUT的主要原因。同时Kim等[20]发现，通过对泪膜稳定性的靶向治疗可以有效延长干眼患者的BUT以及改善患者的主观症状。结合本研究的结果，提示在干眼发展过程中除炎症作用之外，还存在另一条作用途径，即泪膜的不稳定性。
根据以上结果，我们可以大胆推测Nod-1受体蛋白、NF-κB p65蛋白和IL-1β共同参与了干眼炎症反应的发展。因此，了解包括Nod-1受体蛋白在内的NLRs与干眼的关系，特别是在干眼中的表达模式并尽可能阐明其病理生理学，对干眼的NLRs靶向治疗的发展有深远的启发意义。
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