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孔 雪，董 昭，刘海涛，陈 伟，葛 伟
(空军军医大学西京医院全科医学科，陕西 西安 710032)
睡眠质量是影响老年人身心健康的重要因素之一。研究表明，睡眠障碍不仅是老年人罹患糖尿病、心血管疾病及脑卒中的危险因素，而且对老年人的认知和代谢等也会产生明显的影响[1-3]。研究显示，我国60岁以上老年人睡眠障碍发生率高达41.2%[4]。关于老年人睡眠障碍的影响因素，当前的研究结果不尽一致。随着微生物学的发展，越来越多的证据表明肠道菌群参与调节宿主的高级脑功能，当肠道微生态失衡后，将引发身体机能紊乱[5-6]。本研究采用16S rDNA高通量测序的方法，分析老年睡眠障碍患者肠道菌群特征，探索老年人睡眠障碍与肠道菌群的相关性。
1.1 对象
选取2019年7月至2020年11月在空军军医大学西京医院全科医学科住院的60岁以上患者。将有入睡困难、睡眠时间短等症状且匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh Sleep Quality Index, PSQI)评分>10、阿森斯失眠量表(Athens Insomnia Scale，AIS)评分>6的患者作为睡眠障碍组，共25例；
将同期住院，无睡眠障碍主诉且PSQI评分≤10分、AIS评分≤6分的患者作为对照组，共35例。排除标准：①患有严重的肝肾功能损害或器质性消化道疾病；
②入组前4周内服用过益生菌制剂或抗生素类药物；
③入组前4周内服用过治疗胃肠道疾病的药物；
④不签署知情同意书。本研究获得空军军医大学西京医院伦理委员会审核批准(许可证号：KY20192109-F-1)。研究人员充分告知研究对象本研究的目的和意义，保证其资料仅用于科学研究。客观记录研究对象的年龄、性别、身高、体质量及高血压、冠心病、脑卒中等病史。两组患者的一般情况及疾病史见表1，睡眠障碍组在年龄、性别、体质量指数(body mass index，BMI)，以及有无高血压、冠心病、脑卒中等疾病史方面与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05，表1)，具可比性。
表1 两组一般情况及疾病史比较
1.2 方法
1.2.1 评估研究对象的睡眠状况 研究人员采用标准化的指导语以减少主观询问偏倚。使用的量表有：①PSQI，由BUYSSE等[7]编制，用于评估睡眠质量，共由7个部分构成，总分介于0～21之间，分值越低表示睡眠质量越高；
②AIS，以对睡眠的主观感受为主要评定内容，是国际公认的睡眠质量自测量表，共8个条目，总分介于0～24之间，分值越低表示睡眠质量越高。
1.2.2 采集粪便样本 于清晨6:00～9:00用无菌粪便采集管收集研究对象中间段新鲜粪便标本至少1 g，并立刻将采集管放入-80 ℃冰箱保存。
1.2.3 样本总DNA提取及PCR扩增 使用粪便基因组DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.®Stool DNA Kit)提取总DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，采用紫外分光光度计进行定量。将样本总DNA中16S rDNA的V3-V4高变区作为目的片段进行扩增，引物序列为341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。扩增条件为：98 ℃预变性30 s；
98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增后的PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并对目的片段进行切胶回收和纯化定量。
1.2.4 16S rDNA高通量测序及生物学信息分析 样品在Illumina NovaSeq PE250平台上进行测序，将得到的原始数据进行过滤，以获得高质量无杂质的清洁数据。使用QIIME2软件分析，将数据中有效序列相似性大于97%的归为1个操作分类单元，根据操作分类单元在不同样本中的丰度分布，评估每个样本的多样性，通过稀疏曲线来反映测序深度。使用α多样性来反映样本的菌群丰富度、多样性和均匀度，α多样性包括Chao 1指数、Shannon指数和Simpson指数等一系列统计学分析指数，其数值越大表示群落多样性越高。使用Jaccard相似系数来分析比较两组微生物群落β多样性指数，并通过主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)对样品间微生物群落的结构变异进行可视化展示。对各样本在门和属分类水平的菌群群落丰度进行计算。
2.1 睡眠障碍组与对照组肠道菌群α多样性比较
经Wilcoxon秩和检验，睡眠障碍组与对照组Chao 1指数、Shannon指数、Simpson指数差异均无统计学意义(P>0.05，图1)。
2.2 睡眠障碍组与对照组肠道菌群β多样性比较
PCoA显示，睡眠障碍组与对照组在两个主要维度中有一定的分离(图2)，通过进一步加权的Anosim相似性分析得R=0.079，P=0.02，表明睡眠障碍组与对照组的群落结构差异有统计学意义。
2.3 睡眠障碍组与对照组在门和属水平的部分菌种相对丰度比较
在门分类水平，对照组样本中共发现11个菌种，睡眠障碍组样本中共发现10个菌种，两组同有的5个菌种的丰度占比之和均占对照组和睡眠障碍组的99%以上。睡眠障碍组变形菌门的相对丰度较对照组显著下降(P<0.05)，其余菌种相对丰度差异无统计学意义(表2)。
表2 睡眠障碍组与对照组肠道菌群相对丰度在门分类水平的比较 [%,M(QL,QU)]
在属分类水平，对照组样本中共发现316个菌种，睡眠障碍组样本中共发现460个菌种。睡眠障碍组中氏菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、疣微菌科_UCG-010属、丁酸球菌属、罗氏杆菌属、粪球菌_1属、未分类-木犀菌属相对丰度较对照组明显下降(P<0.05)，而海旋菌属、微小单胞菌属、厌氧球菌属、弯曲杆菌属、茎杆菌属、Faecalitalea属相对丰度较对照组明显上升(P<0.05)，其余菌种相对丰度差异无统计学意义。
本研究初步探索了睡眠障碍组老年人肠道菌群变化特征，其多样性与对照组无明显差异，但菌群结构与对照组存在显著差异。在门和属分类水平，两组间部分菌种相对丰度存在显著差异。对两组的年龄、性别、BMI，以及高血压、冠心病、脑卒中等病史进行比较发现，以上因素在两组间差异无统计学意义。
正常情况下肠道菌群的种类、数量及比例处于动态平衡，对人体有至关重要的影响。它们可以为神经递质的产生提供底物，并通过循环系统作用于远端。有研究显示，肠道菌群可以通过神经内分泌和自主神经实现微生物-肠-脑间的信号传递[8-10]。
健康的肠道微生态环境具有较高的多样性，我们的结果显示，对照组的α多样性指数有大于睡眠障碍组的趋势，但差异无统计学意义。与此相一致的是，有研究发现在强制睡眠剥夺后人类和大鼠的肠道微生物多样性没有发生明显变化[11-12]，表明肠道菌群的多样性可能对老年人睡眠调节影响较小。
本研究通过PCoA分析，比较两组患者肠道菌群群落结构相似度，结果显示两组间菌群结构差异有统计学意义。由此可见，患有睡眠障碍的老年人肠道微生物群落结构发生改变。肠道微生物的数量和结构在健康状态下应保持动态平衡，当有内源或外源性因素导致其发生失调时，可影响宿主健康导致疾病发生[13]。睡眠-觉醒周期是一个复杂的节律性生理过程，大脑在这一过程中起着主要的调节作用，而肠道菌群可以通过调节神经递质的产生和运输等途径来调节大脑功能。另外，睡眠质量的高低常常会受到抑郁、焦虑等情绪的影响，而研究发现不良情绪和心理压力会导致肠道菌群紊乱[14-15]，这些结果提示，肠道菌群与老年人睡眠障碍之间的关系可能是通过其对脑功能的影响产生的。
另外，我们的研究显示两组间部分菌群的丰度存在显著差异。在门分类水平，睡眠障碍组的变形菌门丰度显著下降。肠道菌群主要由厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门构成，这些主要菌群相对丰度的稳定对维持肠道菌群稳态起着重要作用。这四大菌门中，相对丰度最不稳定的即为变形菌门，其丰度会随疾病的不同状态而迅速改变，变形菌门的成员具有多变的形态和生理功能，其失衡是生态失调和疾病发生的标志[16]。
在门分类水平观察到的变化可扩展到下游分类群，在属分类水平，睡眠障碍组的氏菌属和丁酸球菌属等8种菌属相对丰度较对照组明显下降；
而微小单胞菌和弯曲杆菌等6种菌属相对丰度较对照组明显上升。这些结果显示，老年睡眠障碍患者肠道微生态环境中某些有益共生菌丰度降低，而另一些需氧致病菌丰度上升。例如，氏菌属可以产生短链脂肪酸，具有影响结肠运动、维持免疫和抗炎等特性，其在肠道中可将代谢从糖酵解转向脂肪分解，被认为是新型有益菌[17-18]。丁酸球菌属产生的丁酸盐可以影响肠道屏障的完整性，且其与高血脂、超重等呈负相关，表明其有调节代谢和增强防御力等作用[19-20]。同样可以产生丁酸盐的粪球菌属，其丰度与心理状态相关，抑郁症患者的粪球菌属丰度相较于健康人群显著降低[21]。另一方面，微小单胞菌是一种机会性致病菌，会引起感染性心内膜炎、肾脓肿、化脓性关节炎等感染性疾病[22-24]，而弯曲杆菌是引起胃肠炎的四大主因之一，具有较强的毒性和致病性[25]，虽然这些菌群与睡眠调节的具体机制尚不清楚，但这些致病菌在感染机体时会导致炎症反应，其可能是通过免疫细胞迁移及机体的抗炎过程等来影响脑的调节功能。
研究的局限性：研究中发现对照组肠道菌群的α多样性有高于睡眠障碍组的趋势，但差异不显著，这可能是由于本研究样本量较小或睡眠障碍组睡眠障碍持续时间较短，多样性减少尚未完全表现出来造成的。另外，本研究尚不能说明老年人睡眠障碍与肠道菌群紊乱何为因何为果，且睡眠障碍常常与抑郁、焦虑等不良情绪相关，但本研究未对此类因素进行排除，因此，肠道菌群与老年人睡眠障碍的关系值得进一步探索，我们将在下一步的研究中改善以上不足。
综上所述，老年睡眠障碍患者肠道菌群存在一定程度的失调，补充益生菌恢复肠道微生态平衡可能对改善老年人睡眠质量有所帮助。
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