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李程 周旻 雷博雅 常青 曹文俊 王朱健
(1.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院检验科 上海 200031；
2.复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)
急性视网膜坏死(acute retinal necrosis,ARN)是一种严重的急性致盲性眼病，主要病因是疱疹病毒感染，其中又以水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)最为常见。该病起病急、进展快、预后差，及时诊断、治疗和监测对于患者预后至关重要。2015 年日本眼科协会把眼内液病毒核酸检测纳入ARN 诊断标准[1]，为ARN 的诊断提供了新的依据。有报道[2-3]证实利用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术可监测ARN 患者房水内病毒载量，帮助评估治疗效果。临床上对于ARN 严重程度的评估，也趋向于通过广角眼底照计算眼底坏死面积来获得更精准的结果。本研究跟踪检测接受我院抗病毒治疗方案的ARN 患者房水中VZV-DNA 载量和患眼眼底坏死面积，分析其动态变化规律，来评估2 个指标对于临床的指导监测价值。
1.1 资料 病例为2016 年8 月～2017 年12 月在本院确诊的ARN 15 例，其中男性11 例、女性4 例，年龄39～71 岁，平均(50.2±8.9)岁，参照美国葡萄膜炎协会推荐的标准进行诊断。所有患者均为单眼发病，确诊前均未接受抗病毒治疗，并排除免疫缺陷疾病。确诊后接受我院联合抗病毒治疗，包括玻璃体腔注射、静脉注射及口服抗病毒药物。研究符合《赫尔辛基宣言》的规定，经复旦大学附属眼耳鼻喉科医院医学伦理委员会批准，并获得15 位患者自愿签署的知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 试剂与仪器 VZV-DNA 检测试剂盒购自上海之江生物技术有限公司，检测仪器为荧光定量PCR仪(ABI7500，ABI 公司，美国)；
超广角眼底照相由超广角眼底照相机拍摄(200Tx，Optos 公司，英国)。
1.2.2 治疗方法 所有患者均接受我院的8 周强化抗病毒治疗，即一旦确诊ARN 即行玻璃体腔注射更昔洛韦(ganciclovir,GCV)，4 mg/0.1 mL，2 次/周，直至无活动性视网膜坏死病灶或其发生视网膜脱离(retinal detachment,RD)需行玻璃体切除术。与此同时，0～2 周静脉滴注更昔洛韦，5 mg/(kg·12 h)。3～8周口服伐昔洛韦(valaciclovir,VCV)，每次600 mg，3 次/d。依据患者眼内炎症的程度决定是否进行玻璃体腔注射或口服皮质类固醇。玻璃体腔注射最多持续4 周。
1.2.3 样本采集 确诊患者在玻璃体腔注射药物之前，行前房穿刺术，取房水标本100 μL。随后在第4 天、约1 周、2 周、3 周和4 周分别取房水100 μL 冻存于-80 ℃。对于病情较轻接受玻璃体腔注射次数较少的患者，当其停止接受玻璃体腔注药时，前房水样本采集也遂停止。房水样本行多重病毒PCR 定性检测，包括单纯疱疹病毒1(herpes simplex virus-1，HSV-1)，HSV-2，VZV，EB 病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)。VZV 阳性的患者再行qRT-PCR 检测病毒载量。
1.2.4 VZV-DNA 定量检测 将VZV-DNA 标准品进行10 倍系列梯度稀释，作为模板进行实时荧光定量PCR，严格按试剂和仪器说明书操作，核酸检出限为1×103/mL，病毒拷贝数单位为copies/mL。
1.2.5 眼底坏死面积计算 由有经验的眼科医师通过广角眼底照对眼底坏死面积进行评估。眼底黄白色坏死病灶评估为活动性坏死病灶，采用图像处理软件计算活动性坏死病灶及整个视网膜区域的像素面积；
眼底坏死面积定义为活动性坏死病灶区域在整个视网膜区域像素面积的占比。
1.3 统计学处理 应用MedCalc 15.8 统计软件进行数据处理和分析，采用Wilcoxon 及Spearman 进行秩和检验及相关系数分析，相关性用r表示，|r|≥0.8 高度相关，≥0.5～＜0.8 中度相关，≥0.3～＜0.5 低度相关，＜0.3 视为不相关。P<0.05 为差异具有统计学意义。
15 例患者房水中VZV-DNA 平均初始载量为(7.08±0.86)lg(copies/mL)，最高载量为8.48 lg(copies/mL)，最低载量为4.88 lg(copies/mL)。以治疗天数为横坐标，患者房水病毒拷贝数对数值为纵坐标绘制成动态曲线图(图1)，接受治疗后患者患眼房水中病毒载量随时间呈下降趋势。
图1 ARN患者房水VZV-DNA载量动态折线图
初诊时有超广角眼底影像资料记录的9 例患者眼底初始坏死面积为27.5%±26.7%，最高为66.9%，最低为1.47%。以治疗天数为横坐标，患眼眼底坏死面积为纵坐标绘制成动态曲线图(图2)，接受治疗后患眼眼底坏死面积逐渐减少。2 例患者初始坏死面积即低于5%；
剩余13 例患者中，11 例接受了治疗后4 周进行超广角眼底成像的采集，其中9 例眼底坏死面积低于5%。
图2 ARN患者眼底坏死面积水平动态折线图
我们对15 例患者房水病毒动态曲线图进行动力学分析，VZV 核酸载量随时间呈对数模型衰减，平均斜率为(-0.098±0.022)log/d，患者VZV 载量半衰期为(3.2±0.7)d(2.2～4.4 d)。我们对患者眼底坏死面积变化曲线进行对数拟合，平均斜率为(-0.066±0.040)log/d，眼底坏死面积半衰期为(6.8±4.7)d (2.1～18.8 d)。VZV 核酸载量衰减斜率要显著高于坏死面积衰减斜率(P=0.035 3)；
病毒核酸载量半衰期显著短于坏死面积半衰期(P=0.015 1)。
通过相关系数分析显示病毒载量衰减斜率与坏死面积衰减斜率不相关(r=-0.289，P=0.2965)；
病毒初始拷贝数与病毒载量半衰期不相关(r=0.0287，P=0.9191)，与眼底坏死面积半衰期中度相关(r=0.539，P=0.038)。
通常认为，ARN 的发病是因为病毒感染淋巴细胞侵入视网膜，破坏视网膜细胞导致细胞死亡或者病毒感染引起视网膜和葡萄膜血管弥漫性炎细胞浸润。通过眼内液病毒核酸的检测来诊断ARN 在临床上已证实具有重要价值，并逐渐应用于临床[4-6]，而眼内液病毒核酸和眼底坏死面积的同步动态变化，以及在监测抗病毒治疗效果的临床价值少有系统性的评估。我们通过连续检测接受抗病毒治疗ARN 患者房水中的VZV 核酸载量及眼底坏死面积，来监测眼内病毒感染及眼底坏死对于抗病毒治疗的动态反应，研究房水连续检测对于治疗方案的疗效监测作用。
一些研究[7-8]显示qRT-PCR 可有效检测病毒活跃性及监测抗病毒治疗的效果。15 例VZV 引起的ARN 患者接受抗病毒治疗后，房水病毒载量呈对数模型下降，眼底坏死灶也逐渐缩小。VZV 载量半衰期为(3.2±0.7)d，与Bernheim等[2]的(3.0±0.7)d 无明显差异。15 例患者患眼中VZV 载量对抗病毒药物反应良好，并无耐药现象，半衰期较为一致，而眼底坏死面积半衰期差异较大，可能与个体差异有关。眼底坏死面积的减少斜率与病毒清除斜率没有相关性(r=-0.289)，且斜率低于病毒清除斜率，半衰期要长于病毒核酸，提示眼底坏死面积的消退要迟于病毒核酸的清除，可能在眼内病毒被逐步清除的过程中，眼底坏死病灶的消退存在一定的滞后。房水中病毒的初始拷贝数与眼底坏死面积半衰期呈中度相关，提示ARN 患者的房水病毒初始载量可能与疾病的预后有关，有待于更大样本量来进一步证实。
本研究存在着局限性：首先，入组病例数不够多；
其次，研究对象中未能收集到有药物抗性的病例来反映病毒载量和坏死面积的相应变化，有待后续更多的病例积累来深入研究。
我们的研究显示观察病毒载量变化有助于监测VZV 诱导的ARN 患者治疗效果，特别当患者临床表现不典型，或者晶状体、玻璃体混浊，影响眼底观察时，病毒的载量检测对临床治疗具有重要指导价值，但依旧不能完全替代眼底视网膜检查。随着算法的优化及软件系统的发展，眼底坏死面积的计算更为精准及标准化，对疗效评估将具有更直观的作用。
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