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柏文 蒋沁
南京医科大学眼科医院，南京 210029
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病重要的微血管并发症，是50岁以上人群致盲的常见原因之一[1]。单纯控制血糖对延缓DR发生和发展的效果并不明显。目前有效抑制DR进展的治疗手段，如激光光凝、玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物和玻璃体切割术等具有一定的组织破坏性，且多用于晚期DR的治疗[2-3]。传统中草药具有天然且安全的特性，其在DR防治中的应用受到越来越多的关注[4]。银杏叶有数千年的临床应用史,目前，银杏叶制剂已于130多个国家使用。基于此，中国医师协会中西医结合医师分会组织知名专家制定了《口服银杏叶制剂临床应用中国专家共识(2020)》以指导和规范银杏叶制剂的临床应用，并推荐银杏叶制剂应用于早期DR患者[5]。大量的基础和临床研究均显示，银杏叶提取物可以安全、有效地减轻视网膜微血管和神经损伤，可作为预防和治疗DR的代替疗法[6-9]。银杏叶含有许多具有药理活性的成分，如类黄酮(槲皮素、山柰酚、木犀草素和异鼠李素等)和萜类化合物(银杏内酯等)[10-11]，对改善血液微循环、调节脂代谢、阻止血凝块形成、抵抗氧化应激和减轻炎症反应等方面具有积极作用[12-14]；
但其治疗DR的具体机制尚未完全明确。因此，需要进一步筛选银杏叶中的活性成分，阐明其改善DR的具体作用通路及机制。网络药理学方法可以研究药物在生物体内作用的潜在机制，能够有效揭示小分子药物的调控原理，并逐渐应用于眼科领域[15-17]。本研究拟通过网络药理学方法探索银杏叶提取物治疗DR的潜在机制，以期为DR治疗提供新的思路。
1.1 数据库筛选银杏叶活性成分及其靶点
检索中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)，以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18为阈值筛选银杏叶活性成分，并根据已知具有药理功能的银杏叶活性成分进行扩充。同时检索TCMSP和Swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库，以Probability>0.3为阈值筛选银杏叶活性成分的已知靶点和预测靶点。
1.2 数据库筛选DR相关靶点并获取银杏叶治疗DR的潜在靶点
以diabetic retinopathy为检索词检索GeneCards(https://www.genecards.org/)和DisGENET(https://www.disgenet.org/home/)数据库中与DR相关的治疗靶点。分别以Relevance score>5和Gene-disease association score>0.1为阈值筛选与DR高度相关的靶点。将得到的靶点与银杏叶活性成分靶点取交集，获取银杏叶治疗DR的潜在靶点。
1.3 银杏叶活性成分-靶点网络构建及关键节点分析
靶点蛋白经Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)规范靶点名称后，导入STRING数据库(https://string-db.org/)。将高等置信度(High confidence>0.7)的靶点蛋白相互作用信息导入Cytoscape 3.8.2软件，构建银杏叶活性成分-潜在治疗靶点网络。利用Cytoscape 3.8.2软件中的NetworkAnalyzer插件，根据节点度值(degree)参数筛选重要程度较高的关键活性成分与关键靶点。度值参数是节点与其他节点相互作用的数目，反映节点的重要程度。
1.4 功能富集分析和通路分析探索靶点的生物学功能与信号通路
使用R软件(R-3.6.3)对银杏叶治疗DR的潜在靶点进行功能富集分析、通路分析和可视化。经org.Hs.eg.db包将上述靶点名称转换成entrez ID后，使用clusterProfiler包以P值<0.05和Q值<0.05为阈值进行基因本体论(Gene Ontology，GO)生物学功能和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路富集分析。根据富集基因数目count值排序，使用enrichplot包对生物学过程、细胞组成与分子功能3个模块的前10条GO条目和前20条信号通路进行可视化。
1.5 分子对接验证银杏叶关键活性成分与关键靶点的结合作用
从Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载关键活性成分mol2格式结构文件，通过Chem3D软件将上述文件转换为pdp格式的3D结构文件。从蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)中直接下载关键靶点蛋白pdp格式的3D结构文件。通过Autodock 4.2软件根据蛋白活性位点设置Gridbox参数范围，并利用Autodock vina 1.1.2软件进行分子对接。PyMOL用于显示靶点蛋白和活性成分的对接示意图。根据结合自由能最低的原则，确定与每个关键靶点蛋白对接最佳的关键活性成分，即结合自由能越低，意味着靶点蛋白与活性成分结合越稳定，相互作用可能性也越大。本研究的设计流程图见图1。
图1 银杏叶提取物对DR治疗作用的研究设计流程图 DR：糖尿病视网膜病变Figure 1 Research design flowchart of effect of ginkgo leaves extract on DR DR:diabetic retinopathy
2.1 银杏叶活性成分
在TCMSP数据库中共检索到307个银杏叶化合物成分。根据口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18筛选后，补充文献[18]中含量较高且具有药理活性的银杏叶成分银杏内酯A，共得到27个银杏叶活性成分。银杏叶活性成分基本信息见表1。
2.2 银杏叶治疗DR的潜在靶点
根据Swiss target prediction数据库预测得到活性成分的118个作用靶点，TCMSP数据库中收录活性成分的224个作用靶点，最终合并得到银杏叶13个活性成分的312个作用靶点。在GeneCards和DisGENET数据库共检索到1 553个DR相关治疗靶点，筛选出196个与DR高度相关的靶点。将312个银杏叶活性成分作用靶点与196个DR相关治疗靶点取交集，得到共同靶点34个，作为银杏叶治疗DR的潜在靶点(图2)。
图2 银杏叶治疗DR的潜在靶点Venn图 DR：糖尿病视网膜病变Figure 2 Venn diagram of potential targets of ginkgo folium in the treatment of DR DR:diabetic retinopathy
2.3 功能富集分析和通路分析
2.3.1银杏叶治疗DR潜在靶点的生物学功能 在生物过程中，靶点主要涉及化学应激、氧化应激、活性氧代谢和蛋白激酶B信号等；
在细胞组分中，靶点主要涉及分泌颗粒腔、胞浆囊泡腔、膜区域和脂筏等；
在分子功能中，靶点主要涉及受体配体活性、信号受体激活剂活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性和生长因子活性等(图3A)。
图3 银杏叶治疗DR的潜在靶点GO及KEGG富集分析 A：GO富集分析 B：KEGG富集分析 AGE-RAGE：晚期糖基化终末产物及其受体；
MAPK：丝裂原活化蛋白激酶；
PI3K-Akt：脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B；
HIF：缺氧诱导因子；
TNF：肿瘤坏死因子；
IL：白细胞介素；
EGFR：表皮生长因子受体Figure 3 GO and KEGG enrichment analysis for the potential targets of ginkgo folium in the treatment of DR A:GO enrichment analysis B:KEGG enrichment analysis AGE-RAGE:advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product;MAPK:mitogen active protein kinase;PI3K-Akt:phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B;HIF:hypoxia inducible factor;TNF:tumor necrosis factor;IL:interleukin;EGFR:epidermal growth factor receptor
2.3.2银杏叶治疗DR潜在靶点的生物学信号通路 靶点参与多种信号通路，包括糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物及其受体(advanced glycation end product-receptor for advanced glycation end product，AGE-RAGE)信号通路，与血流动力学相关的流式剪切应力和动脉粥样硬化通路，与细胞生存、增生以及调节血管生成相关的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen active protein kinase，MAPK)信号通路和磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt)信号通路，与缺氧应激相关的缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信号通路，以及与免疫和炎症相关的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)信号通路和白细胞介素(interleukin，IL)-17信号通路等(图3B)。
2.4 银杏叶活性成分-潜在治疗靶点网络及其关键节点
网络中度值排名前4位的关键活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素和异鼠李素，排名前8位的关键靶点为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(serine/threonine protein kinase 1，AKT1)、VEGF-A、IL-6、TNF、内皮型一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3，NOS3)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARG)、IL-10和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)(图4)。
图4 银杏叶活性成分-潜在治疗靶点网络构建 节点大小与度值相关，度值越大，节点越大。红色节点为银杏叶活性成分，紫色节点为蛋白靶点Figure 4 Construction of active components-potential therapeutic targets network Node size was related to the degree value,the greater the degree value,the larger the node.Red nodes represented active components in ginkgo folium,and purple nodes represented protein targets
表2 关键活性成分与关键靶点的分子对接信息Table 2 Information of molecular docking between key active components and key targets关键靶点关键化合物结合自由能(kcal/mol)关键靶点关键化合物结合自由能(kcal/mol)AKT1槲皮素-9.8NOS3槲皮素-8.1山柰酚-9.5山柰酚-9.7木犀草素-9.7木犀草素-8.8异鼠李素-9.6异鼠李素-8.3VEGFA槲皮素-7.4PPARG槲皮素-9.4山柰酚-7.1山柰酚-8.2木犀草素-7.2木犀草素-8.8异鼠李素-7.1异鼠李素-9.6IL-6槲皮素-6.7IL-10槲皮素-6.7山柰酚-6.6山柰酚-6.6木犀草素-6.9木犀草素-6.9异鼠李素-6.8异鼠李素-6.8TNF槲皮素-8.5MMP-9槲皮素-10.7山柰酚-7.8山柰酚-10.2木犀草素-8.2木犀草素-10.8异鼠李素-8.4异鼠李素-10.1 注:AKT:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;VEGFA:血管内皮生长因子A;IL:白细胞介素;TNF:肿瘤坏死因子;NOS:一氧化氮合酶;PPARG:过氧化物酶体增生物激活受体γ;MMP:基质金属蛋白酶 Note:AKT:serine/threonine protein kinase;VEGF-A:vascular endothelial growth factor A;IL:interleukin;TNF:tumor necrosis factor;NOS:nitric oxide synthase;PPARG:peroxisome proliferator activated receptor-γ;MMP:matrix metalloproteinase
2.5 银杏叶关键活性成分与关键靶点结合作用的验证
关键活性成分与关键靶点对接结果显示结合自由能均≤-5.0 kcal/mol，说明关键活性成分与关键靶点的对接较好(表2)。槲皮素与AKT1的Ser205、Thr211、Ile290、Lys268氢键连接(图5A)，与VEGFA的Leu66氢键连接(图5B)，与TNF的Tyr123、Ser107、Gln110、Glu124氢键连接(图5C)。山柰酚与NOS3的Met358氢键连接(图5D)。木犀草素与IL-6的Arg16、Leu19、Arg24、Gln28氢键连接(图5E)，与IL-10的Glu142氢键连接(图5F)，与MMP-9的Met247、Ala189、Gln227氢键连接(图5G)。异鼠李素与PARRG的Gln273、Thr268氢键连接(图5H)。
图5 关键活性成分与关键靶点的分子对接示意图 A～C：槲皮素与AKT1、VEGFA和TNF分子对接 D：山柰酚与NOS3分子对接 E～G：木犀草素与IL-6、IL-10和MMP-9分子对接 H：异鼠李素与PARRG分子对接 绿色结构代表蛋白靶点，红色结构代表蛋白靶点的氨基酸残基，蓝色结构代表银杏叶活性成分，黄色虚线代表氢键及其键长(Å)Figure 5 Schematic diagram of molecular docking between key active components and key targets A-C:Molecular docking of quercetin with AKT1,VEGFA and TNF D:Molecular docking of kaempferol with NOS3 E-G:Molecular docking of luteolin with IL-6,IL-10 and MMP-9 H:Molecular docking of isorhamnetin with PARRG Green structure represented protein targets.Red structure represented amino acid residues of protein targets.Blue structure represented active components of ginkgo folium.Yellow dotted line represented hydrogen bond and its bond length (Å)
本研究中确定了27个银杏叶活性化合物和34个银杏叶治疗DR的潜在靶点。根据银杏叶活性成分与其潜在治疗靶点的相互作用网络节点的度值，进一步获取了4个关键活性成分，包括槲皮素、山柰酚、木犀草素和异鼠李素，以及8个关键治疗靶点，包括AKT1、VEGF-A、IL-6、TNF、NOS3、PPARG、IL-10和MMP-9。既往研究表明，这些关键活性成分在DR治疗中起重要作用，如槲皮素可以减少高糖诱导的TNF和IL-6的产生，并降低DR大鼠MMP-9和VEGF表达[19-20]；
木犀草素和槲皮素在体内外均可以抑制VEGF诱导的新生血管形成[21-23]；
山柰酚也可以通过靶向抑制VEGF来抑制高糖环境下人视网膜内皮细胞的血管生成能力[24-25]。此外，关键活性成分和关键靶点之间分子对接的结果也验证了它们之间存在结合活性。
本研究中对银杏叶治疗DR的34个潜在靶点进行了GO和KEGG富集分析，结果表明银杏叶中的活性成分主要通过脂筏、分泌颗粒腔和胞浆囊泡腔等细胞组分参与调节AGE-RAGE、MAPK、PI3K-Akt、HIF-1、TNF和IL-17等信号通路，发挥抗炎、抗氧化应激、减轻缺氧诱导损伤和抑制血管生成作用以延缓DR进展。这些信号通路可能是DR的潜在治疗靶标。AGE-RAGE信号通路异常是引起糖尿病大血管和微血管并发症的重要原因[26]。AGE与RAGE结合会引起强烈的信号级联反应，诱导下游MAPK和PI3K-Akt等信号通路的异常激活，导致视网膜微血管的损伤，例如内皮功能障碍、周细胞凋亡、新生血管形成和血管炎症等[27-29]。先前的研究报道了缺氧通过促进新生血管形成和血管营养不良在DR进展中起重要作用[30-31]。在DR中，缺氧相关的HIF-1信号通路通过影响VEGF表达调节视网膜新生血管发育，也可以通过调节促炎因子IL-6和TNF-α的表达参与炎症反应[32-33]，通过抑制TNF和IL-17信号通路介导的炎症改善视网膜微血管和神经元损伤[33-34]。这提示银杏叶提取物可作用于多细胞组分，调节多条信号通路，产生不同生物学功能，从而发挥治疗DR的功效。
综上所述，本研究对银杏叶治疗DR的活性成分、关键靶点及可能的作用机制进行网络药理学分析，并通过分子对接验证了化合物与靶点之间的结合活性，为进一步了解银杏叶提取物治疗DR的药理机制奠定了基础，但仍有待未来进一步的实验研究加以验证。
利益冲突所有作者均声明不存在任何利益冲突
志谢感谢复旦大学附属眼耳鼻喉科医院研究院颜标教授给予本文重要的建议和帮助
作者贡献声明柏文：实验操作、数据整理、论文撰写及修改；
蒋沁：设计实验、实验指导、论文审阅
