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李文超 苗艳
（1.黑龙江省方正县农业农村局，黑龙江哈尔滨 150800；
2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161005）
ESBL（extended-spectrum β-Lactamase）是指超广谱β-内酰胺酶，是一类能水解青霉素类、头孢菌素类，以及单环类抗生素的β-内酰胺酶。ESBL 基因通常由质粒携带，促进其在革兰氏阴性菌中的传播。一些监测研究表明在亚太地区产ESBL 的生物高度流行，其中以TEM 型β-内酰胺酶、SHV 型β-内酰胺酶和CTX-M 型β-内酰胺酶最为常见，尤其是β-内酰胺酶（bla）中的CTX-M 基因型在亚洲占优势，且在很多国家呈现大规模流行[1]。由于该基因多定位于质粒，容易通过接合性转导在不同细菌间传递。因此，本实验通过接合转导方法，以进一步确定鸡大肠杆菌分离株ESBL 耐药基因的可转移性。
1.1 材料
1.1.1 菌株
试验选取11 株blaCTX-M 基因型ESBL 大肠杆菌分离株（不携带其他基因型，由吉林大学动物传染病诊断与防治教研室提供）平板复苏，37℃恒温箱培养16～18h，挑取单菌落，接种于LB 固体培养基，37℃恒温箱培养16～18h；
利福平抗性的DH5α 标准株购于北京华越洋生物，质控菌株ATCC25922 购自中国普通微生物菌种保存中心。
1.1.2 药物及培养基
琼脂粉、培养基购自杭州天和微生物试剂有限公司；
头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和氨曲南药敏片购自杭州天和微生物试剂有限公司；
抗生素干粉购自哈药集团制药总厂；
质粒提取试剂盒（TaKaRa Mini BEST Plasmid Purification kit）购 自QIAGEN 公 司；
核酸分子量标准品购自TIANGEN 生化科技有限公司；
Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs 购自TaKaRa 公司；
DNA 凝胶回收、纯化试剂盒购自长春百奥生物技术有限公司；
琼脂糖购自Spanish 公司；
溴化乙锭（EB）购自北京爱普华美生物技术有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 菌液制备
挑取利福平抗性DH5α 和供体菌病鸡ESBL 型大肠杆菌分别在含有利福平抗性终浓度为50μg/mL 和头孢唑林4μg/mL 的LB 固体平板上划线，置于37℃温箱中，培养过夜，次日，分别挑取利福平抗性DH5α和供体菌病鸡ESBL 型大肠杆菌单菌落接入5mL 的LB 中，置于37℃摇床，180～200r/min，震荡过夜。
1.2.2 体外接合转导过程
取供体菌大肠杆菌菌液1mL 和受体菌DH5α 菌液2mL 充分混合，过微孔滤膜。取下滤膜，置于LB固体培养基中（菌体面向上，不与琼脂面接触），平板倒置于37℃温箱孵育4h 以上。
1.2.3 体外转导成功菌株筛选
取下滤膜，使用1mL 0.85%的生理盐水清洗膜上的细菌，1000r/min 离心1min，收集菌体，然后用100μL 的生理盐水重悬菌体，稀释适当的倍数涂布于双抗板（终浓度利福平200μg/mL 和头孢唑林50μg/mL 的胰蛋白酶大豆琼脂培养基）上上筛选接合转导子。
1.2.4 接合转导子的检测
在上述双抗板上挑取单个菌落，接种于双抗液体胰蛋白酶大豆琼脂培养基，37℃培养16h，进一步筛选接合转导子，并对筛选到的接合子进行ESBL 初筛和确证。根据我国药敏试验结果判断标准参照CLSI（Clinical and Laboratory Standards Institute）推荐使用的ESBL 初筛实验方法进行，MH 琼脂培养基接种接合子，选用头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和氨曲南按照标准纸片扩散法进行操作[2]，记录各纸片抑菌环直径与标准对比进行初筛（表1）。
表1 初筛ESBL 表型解释标准
只要其中有一种或一种以上抗生素纸片抑菌直径符合上述标准可视为ESBL 可疑株。将可疑菌株按0.5 麦氏浊度再次涂布MH 琼脂培养基平板上，按照标准纸片扩散法进行操作[2]，选用头孢他啶、头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟、头孢噻肟/克拉维酸进行ESBL 表型确证实验（表2）。
表2 确证ESBL 表型解释标准
再用ESBL 耐药基因的扩增方法对筛选到的接合子进行PCR 检测。由于大多数的ESBL 基因被证实是定位在质粒上，使用质粒提取试剂盒提取确认为ESBL 的大肠杆菌的质粒并纯化，然后PCR 扩增主要常见的TEM、SHV 和CTX-M3 种类型bla 基因，引物由invitrogen 公司合成（表3）。
表3 本试验使用的引物
在反应体系下（表4），反应条件分别为：
表4 PCR 反应体系
SHV 和TEM；
94℃预变性3min；
94℃变性30s、48℃退火30s、72℃延伸1min，共30 个循环；
72℃再延伸10min。
CTX-M：94℃预变性7min；
94℃变性50s、50℃退火40s、68℃延伸1min，共35 个循环；
68℃再延伸5min。
将PCR 扩增产物进行1.0%（w/v）琼脂糖凝胶电泳检测，EB 染色（0.5μg/mL），观察结果。
对PCR 产物进行纯化，然后连接至T 载体（Promega），测序。通过BLAST 进行网上序列分析。
接合转导后，对双抗板上筛选的接合转导子进行ESBL 确认以及PCR 检测耐药基因验证，结果表明，得到的11 株阳性接合子均呈现ESBL 表型；
扩增结果显示，11 株转移接合子的bla 基因型均为CTX-M型（见图1），转移率为100%，用TEM 和SHV 引物扩增结果均为阴性。
图1 接合子CTX-M 基因的检测（部分结果）
接合是细菌间DNA 自然传递的最常见方式，革兰氏阴性杆菌耐药率增长的最重要机制是质粒通过接合播散所携带的耐药基因[3]。产ESBL 大肠杆菌携带的质粒分为接合性质粒与非接合性质粒两种，非接合性质粒占小部分。blaCTX-M 基因借助接合性质粒实现耐药基因的水平转移，通过菌株接合方式实现耐药基因在同种属的革兰阴性菌或不同种属的革兰阳性菌间迁移扩散[4]。
本次接合转导实验的结果表明，这些ESBL 表型鸡源大肠杆菌所携带的CTX-M 型bla 基因能够通过质粒在不同的菌株之间转移，并使受体菌株呈ESBL表型，转移率为100%，说明受体菌获得bla 基因后能高效表达。这也在一定程度上说明产ESBL 大肠杆菌耐药现象严重的原因。虽然食用动物身上的耐药菌是否能够通过食物链传播至人类，现在尚未有确凿证据，但在食用动物上这些ESBL 型菌株的流行和传播确实对人类健康构成了潜在的威胁。
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