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丁 戈, 熊 洁, 陈伦林, 李书宇, 宋来强
(江西省农业科学院作物研究所, 国家油料改良中心南昌分中心, 江西省油料作物生物学重点实验室, 农业农村部长江中下游作物生理生态与耕作重点实验室, 南昌 330200)
乙草胺(acetochlor, 分子式C14H20ClNO2)登记产品可安全用于油菜Brassicanapus[1]、玉米Zeamays[2]、大豆Glycinemax[3]、棉花Gossypiumspp.[4]、马铃薯Solanumtuberosum[5]、花生Arachishypogaea[6]等作物田中一年生禾本科杂草占优势的旱地土壤封闭除草。土壤湿度对乙草胺的安全性影响较大,在乙草胺过量施用时,高湿(含水量30%以上)和干旱(含水量10%～15%)都会加重作物的药害[7]。我国冬油菜优势产区长江中下游地区自1951年来秋季干旱趋势加重,极端降雨频率显著升高[8],在这类极端气候条件下使用乙草胺容易在油菜上产生药害。干旱气候条件会导致除草效果差,而种植户由于缺乏科学施药技术普遍选择加大施药剂量,结果导致作物药害加重[9]。可通过增施有机肥减弱作物对土壤中农药的吸收并提供作物恢复生长的养分,或选择安全剂、拌种剂、解毒剂等产品以提高敏感作物或品种的解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferase, GST)活性来缓解乙草胺药害。例如,二氯丙烯胺、苯叉酰胺等二氯乙酰氨类化合物作为安全剂与乙草胺混合后进行土壤喷雾,可提高玉米幼苗GST活性[10]。采用内生真菌印度梨形孢Piriformosporaindica菌丝拌种可提高油菜幼苗地上部GST活性[11]。微生物菌剂枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis拌种可提高油菜叶片中GST活性[12]。出苗期喷施解毒剂芸苔素内酯可提高油菜叶片中GST活性[13]。近年来,国内非转基因抗除草剂油菜新种质创制和抗性油菜品种选育取得丰硕成果[14],育成了我国第1个非转基因抗磺酰脲类除草剂油菜新品种‘宁R101’[15]。抗除草剂性状在油菜杂交制种的应用有利于提高化学杀雄制种过程中父本安全性,扩大制种规模,提升杂交种F1纯度。抗除草剂油菜新品种的推广,有利于推动我国油菜全程机械化生产。目前关于乙草胺胁迫下不同油菜品种萌发期幼苗生长及生理的研究较少,本研究对乙草胺处理下的不同耐药性油菜品种幼苗的生物、生理性状进行了较系统的比较分析,以期深入揭示不同油菜品种对乙草胺耐药性差异机理,为非转基因耐乙草胺的油菜新种质选育提供科学依据。
1.1 供试材料
试验油菜品种:前期筛选的120份甘蓝型油菜种质资源由中国农业科学院作物科学研究所提供。以油菜萌发期的直立表型幼苗数作为乙草胺耐药性主要测定指标,筛选获得的乙草胺耐药品种‘Norin 41’和敏感品种‘Dong Hae 1’作为试验品种。
供试除草剂:50%乙草胺乳油由山东胜邦绿野化学有限公司生产,在油菜田的制剂用药量为1 050～1 500 mL/hm2,兑水600～900 L/hm2,土壤喷雾的有效成分含量为0.052%～0.125% (V/V)。
1.2 试验设计与处理
选取正常籽粒,均匀放置在铺有一层发芽纸的带盖透明发芽盒内(外径规格：长12 cm×宽12 cm×高5 cm)。发芽盒置于人工气候室,培养温度为(20±2)℃,光周期为L∥D=16 h∥8 h。从杂草控制的角度设定乙草胺处理剂量(有效成分含量，下同),以0.03% (V/V)为低浓度处理组,油菜田喷雾下限含量0.06% (V/V)为中等浓度处理组,0.08%(V/V)为高浓度处理组,每个试验组设3个重复,每个重复为50粒种子/发芽盒,对照组为水处理。模拟农田播种后当天用药,在第1天滴加5 mL乙草胺处理液(0, 0.03%, 0.06%, 0.08%)湿润发芽纸,第2天至第8天培养期间,每天添加适量的水(1～2 mL)以保持发芽纸湿润。第8天拍照、性状调查、数据记录和取样。样品液氮速冻后-70℃保存待测。
1.3 调查和分析方法
每天统计种子萌发数,第8天测定发芽率并统计直立表型幼苗数。试验组每个重复随机抽取10株幼苗,滤纸吸干表面水分,刻度尺测定胚根(根)和下胚轴(茎)长度,精密电子天平称量幼苗总鲜重。酶活性分析参照臧丽丽等[16]的方法,采用苏州科铭生物技术有限公司检测试剂盒并按照说明书操作。试验组每个重复称取0.1 g整株鲜样,加入预冷的1 mL提取液于冰浴研磨匀浆,8 000 r/min,4℃离心10 min,取上清液为样品提取液,置冰上待测。WST-8法(货号SOD-1-W)测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性,以在25℃,黄嘌呤氧化酶藕联反应体系抑制百分率为50%时,每克鲜样在每毫升反应体系中的SOD活性力定义为1个酶活力单位。过氧化氢消耗法(货号CAT-1-Y)测定过氧化氢酶(catalase, CAT)活性,以在25℃,每克鲜样每分钟催化1 nmol H2O2降解定义为1个酶活力单位。愈创木酚氧化法(货号POD-1-Y)测定过氧化物酶(peroxidase, POD)活性,以在25℃,每克鲜样在每毫升反应体系中每分钟的OD470变化0.5为1个酶活力单位。CDNB法(货号GST-1-W)测定GST活性,以在25℃,每克鲜样每分钟催化1 nmol CDNB与GSH结合为1个酶活单位。DTNB 法(货号GSH-1-W)测定还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量。2-VP法(货号GSSG-1-W)测定氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide, GSSG)含量。硫代巴比妥酸法(货号MDA-1-Y)测定丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。
1.4 数据分析
数据由Microsoft Excel 2016录入。柱图、盒须图、线图、相关性热图由GraphPad Prism 8绘制。柱图、线图数据为3次生物学重复的算数平均值±标准差。盒须图上、下须表示最大、最小值,植株数n=30。主成分分析图由OriginPro 2019b绘制。图注由Adobe Photoshop CS5标注。样本均值的多重比较分析(最小显著性差异法)和t测验分析采用IBM SPSS Statistics 24分析。
2.1 乙草胺对萌发期幼苗生物性状的影响
在3个处理组中,两个品种的直立苗表型差异显著(图1),耐药品种‘Norin 41’的直立苗率显著高于敏感品种‘Dong Hae 1’(图1b)。在0.06%处理组,耐药品种的直立苗率在90%以上,而敏感品种的直立苗率低于50%。在0.08%处理组,耐药品种的直立苗率为72.8%,而敏感品种直立苗率为34.7%。乙草胺处理不影响发芽率和萌发曲线。各试验组第3天的萌发率均已达90%以上,在第8天的发芽率达96%以上,两个品种表现一致,没有显著差异(图2)。对照组中，敏感品种和耐药品种的鲜重分别是0.058 g和0.060 g;在0.03%和0.06%处理组,两个品种的鲜重表型差异显著(图3a),耐药品种和敏感品种的鲜重约是对照的50%。在3个处理组中,两个品种的根-茎比表型差异显著(图3b),耐药品种的根-茎比从对照组的4.490降至处理组的1.663～1.950；
敏感品种则从对照组的3.097降至处理组的1.083～1.290。耐药品种‘Norin 41’表现出整株鲜重高,根-茎比值大和直立苗率高的表型,表明耐药品种整体生长和根部抗倒伏性更强。
图1 乙草胺处理后不同油菜品种萌发期幼苗的直立表型Fig.1 Erect phenotypes of seedlings of different rapeseed varieties treated with acetochlor at germination stage
图2 乙草胺处理后不同油菜品种萌发曲线Fig.2 Germination curves of different rapeseed varieties treated with acetochlor
图3 乙草胺处理后不同油菜品种萌发期幼苗的生物学表型Fig.3 Biological phenotypes of seedlings of different rapeseed varieties treated with acetochlor at germination stage
2.2 乙草胺对萌发期幼苗生理性状的影响
3个处理组中,敏感品种‘Dong Hae 1’的GST活性只在0.08%处理浓度下显著升高,而耐药品种‘Norin 41’的GST活性随处理浓度升高而升高,且比敏感品种高1.2～1.8倍(P<0.05,图4a)。两个品种的GSSG含量和GSH含量的比值随处理浓度升高呈现出上升的趋势(图4b),在对照组、0.03%和0.06%处理组,耐药品种GSSG和GSH含量的比值比敏感品种高1.3～1.7倍(P<0.05)。这些数据表明,耐药品种‘Norin 41’消耗GSH和合成GSSG能力更强,具有更强的乙草胺和活性氧解毒能力。
图4 乙草胺处理后不同油菜品种谷胱甘肽S-转移酶活性和氧化型-还原型谷胱甘肽比Fig.4 The GST activity and GSSG-to-GSH ratio in different rapeseed varieties treated with acetochlor
随着处理浓度的升高,两个品种的SOD活性都呈现出下降的趋势,处理组耐药品种‘Norin 41’的SOD活性约是敏感品种‘Dong Hae 1’的1.2倍(P<0.05,图5a)。两个品种的CAT活性都呈现出升高的趋势(图5b),在0.06%和0.08%处理组,耐药品种的CAT活性为敏感品种的1.2倍(P<0.05)。两个品种的POD活性都呈现出升高的趋势(图5c),在对照组和0.06%处理组,耐药品种的POD活性为敏感品种的78%～86%,在0.03%和0.08%处理组,两个品种的POD活性处于同一水平。敏感品种膜脂过氧化副产物MDA含量变化呈现“厂”形曲线,处理组MDA含量显著高于对照组(图5d)。耐药品种MDA含量变化呈现“凵”形曲线,0.03%和0.06%处理组的耐药品种的氧化损伤较少,其MDA含量为敏感品种的72%～76%,而在对照组和0.08%处理组,两个品种的MDA含量处于同一水平。这些数据表明,不同油菜品种的代谢酶活性存在差异,耐药品种‘Norin 41’具有更强的抗氧化能力。
图5 乙草胺处理后不同油菜品种抗氧化酶活性与丙二醛含量Fig.5 The antioxidant enzyme activity and MDA content in different rapeseed varieties treated with acetochlor
2.3 表型性状的相关性分析
针对耐药品种和敏感品种表型性状的相关性分析表明，乙草胺耐药性主要表型直立苗率与根-茎比(r=0.602,P<0.01)、鲜重(r=0.592,P<0.01)、SOD活性(r=0.824,P<0.01)呈极显著正相关(图6)。其中与直立苗率正相关性最明显的为SOD活性,表明SOD在抗胁迫过程中发挥了重要作用。MDA含量与SOD活性(r=-0.704,P<0.01)呈极显著负相关,表明SOD酶活越高,活性氧清除速度越快,膜脂过氧化程度越低。
2.4 表型性状的主成分分析
针对耐药品种和敏感品种表型性状的主成分分析表明，主成分1(principal component 1, PC1)和主成分2(PC2)的贡献率分别为57.08%和22.24%,累计贡献率为79.32%,特征值均大于1(表1),是反映乙草胺耐药性状的重要主成分,可以代表10项性状大部分信息。特征向量(表2, 图7)表明,直立苗率、根-茎比、鲜重、SOD活性与PC1正相关性较强。PC1主要反映了生长状况,样品点的PC1值越大,生长状况越好。MDA含量与PC2正相关性较强，而GST活性与PC2负相关性较强。PC2主要反映了氧化损伤和解毒状况,样品点的PC2值越大,氧化损伤越严重,解毒状况越差。主成分分析双坐标轴双序图(图7)表明,同一品种的处理组距离较近,而不同品种的处理组距离较远,表明品种差异是决定乙草胺耐药性的关键因素。反映品种耐药性的主要因素是直立苗率、根-茎比、鲜重、SOD活性、GST活性和MDA含量(表2, 图7)。
图6 乙草胺处理后不同油菜品种性状间的相关性分析Fig.6 Correlation analysis of different phenotypic traits of rapeseed treated with acetochlor
表1 乙草胺处理后不同油菜品种表型性状的主成分特征值及方差贡献率
表2 乙草胺处理后不同油菜品种表型性状的特征向量的主成分特征值
图7 乙草胺处理后不同油菜品种表型性状的主成分分析双坐标轴双序图Fig.7 PCA biplot of phenotypic traits in different rapeseed varieties treated with acetochlor
本研究发现直立苗率、根-茎比、鲜重、SOD活性、GST活性和MDA含量是反映油菜品种耐药性的主要因素,这些性状可以为非转基因耐乙草胺的油菜新种质选育提供理论参考,培育的新种质在杂交制种中能保持耐乙草胺父本纯度。有机质是影响土壤对农药吸附作用的关键因子,通常土壤中有机质会吸附、固定农药从而减少作物对土壤中农药的吸收[17]。土壤微生物是影响乙草胺持效性的主要因素[18-19],适宜微生物生长和促进其代谢的环境因子会促进微生物对乙草胺的降解、转化,从而缩短乙草胺持效期。谢湘波[20]的研究表明,在湖南试验点油菜移栽后3 d,喷施0.125%乙草胺(有效成分含量)1次,施药2 h后地表土(0～10 cm)的乙草胺原始沉积量为2.41 mg/kg,土壤和油菜植株的乙草胺半衰期分别为5.2 d和2.3 d。在同等乙草胺施用剂量下,由于试验培养基质和土壤在理化性质、微生物丰度以及乙草胺施用方式等方面存在不同,培养基质的乙草胺有效含量和半衰期会高于表层土壤。试验考察的生物、生理性状选择范围有局限性,因此只揭示了一部分乙草胺响应过程。作物对非生物胁迫的生理响应过程涉及遗传背景(基因组)、基因表达(转录组)、蛋白质表达(蛋白组)和代谢产物调控(代谢组)。随着基因组技术[21]、转录组技术[22]、蛋白组技术[23]和代谢组技术[24]在油菜的成功应用,后续研究可以开展乙草胺耐药品种的多组学分析和高通量数据解析,在生物学功能、细胞过程和代谢通路等方面相互验证基因产物的调控变化,从而进一步发掘耐药品种的乙草胺响应过程的相关代谢物、酶及调控基因。通过发掘作物的除草剂耐药基因,以分子标记和育种工程选育的耐除草剂作物品种是实现高效除草并保障作物正常生长的有效途径。
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