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刘 婷，夏鹏亮，解晓菲，罗心诚，王 怡，胡宗伟，张浩然，张 燚，王玉雪，王香萍，张建民*
(1.长江大学农学院，湖北 荆州 434000；
2.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000)
内生昆虫病原真菌(Endophytic insect-pathogenic fungi，EIPF)具有多种功能，作为杀虫剂可穿透害虫表皮层直接感染和杀死害虫，部分则可定殖于植物根系为植物提供多种益处，包括促生、提高植物抗逆性以及防治害虫等作用[1-2]。
目前，昆虫病原真菌绿僵菌作为杀虫剂已广泛用于害虫的绿色防控，部分绿僵菌可作为植物内生菌，对植物生长和抗逆境等具有积极的影响，这在近年来成为研究热点。本文主要对植物内生绿僵菌的研究现状进行分析和阐述。
绿僵菌(MetarhiziumSpp.)隶属于真菌门(Eumycota)子囊菌亚门(Ascomycotina)核菌纲(Pyrenomyceles)球壳菌目(Sphaeriales)麦角菌科(Clavicipitetaceae)。在1879年俄国生物学家Metchnikoff首次从奥地利金龟子上成功分离得到金龟子绿僵菌(M.anisopliae)，并将其应用于防治奥地利金龟子(Anisopliaaustriaca)和甜菜象甲(Cleonuspunativentris)，随后绿僵菌逐渐成为农业害虫生物防治的研究热点[3]。随着研究的逐步深入，人们陆续认识到绿僵菌是一类种类丰富、分布广泛的昆虫病原真菌，可感染和杀死各类节肢动物(包括昆虫)。同时，大多数绿僵菌还是腐生菌、根际真菌及有益根系内生菌，并具备在不同生命周期转换的能力[4]。绿僵菌具有5个基本特征：菌落初期呈现出白色，产孢时表现出不同程度的绿色；
分生孢子梗单生或者聚集，呈分生孢子梗座；
分生孢子以粘液粘成平行排列的柱状孢子团；
分生孢子长形至长椭圆形；
可感染寄生昆虫[5]。绿僵菌生长最适温度在24～26℃之间，最适pH值在6.9～7.4之间，此外，绿僵菌适合生长在含有机氮源的培养基中。在干燥的情况下，绿僵菌分生孢子可以保存3年以上[6]。迄今为止，已报道的绿僵菌可以在直翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目等8个目42个科200多种昆虫体内寄生，甚至可在螨类及线虫等中寄生[7]。以上特点使绿僵菌成为广泛使用的生物杀虫剂之一。
植物内生绿僵菌的主要功能是具有杀虫作用、促生作用以及提高植物抗病虫的能力。
2.1 对植物的促生作用
绿僵菌除了杀虫作用外，一些绿僵菌还具有促进植物生长的作用。已有多个研究表明绿僵菌可以促进植物的生长，尤其是在胁迫条件下。如绿僵菌可显著增加洋葱产量，促进番茄果实变大，促进盐胁迫下豌豆幼苗和缺肥条件下玉米的生长[8-11]。一般情况下，绿僵菌等真菌通过吸收磷和其他营养物质来显著促进植物生长，此外，还可从腐烂的有机物中捕获氮素，并有助于氮在土壤中储存[12]。有研究表明，绿僵菌可通过浸种、种子包衣等方法与植物建立共生关系[13-14]。而绿僵菌和植物共生关系建立与绿僵菌黏附素(MAD2)有关，当分生孢子接触植物根表面时，MAD2促进分生孢子附着到根表面[15]。但是绿僵菌如何穿透植物表皮，而且植物细胞间的绿僵菌菌丝如何循序渐进的在细胞壁周围生长上尚不清楚。相关研究表明金龟子绿僵菌的MAD1黏附素与对昆虫的毒力相关，而MAD2黏附素则能够使金龟子绿僵菌黏附于植物，这一事实表明金龟子绿僵菌具有特殊的基因来维持其双功能的生活方式[16]。其他的特异性调控基因则包括一种新型的运输根际和根定殖所需的根源养分低聚糖转运体，一种在腐食营养和致病性中扮演重要角色的RNA结合蛋白[17]，一种帮助调节水解酶的转化酶[18]。此外，绿僵菌能在整个冬季在卷心菜的根部保持较高水平，这种优势可使作为根内生菌的绿僵菌在植物死亡后为自身营腐生生活提供营养[19]。目前绿僵菌在植物中的内生作用已在棉花、玉米和番茄等植物中进行了大量研究，如廖兴刚等研究发现罗伯茨绿僵菌(M.robertsii)(Mr2575，Mr23和Mr1046)、M.anisopliae(Ma808，Ma932和Ma939)、M.brunneum(Mb820，Mb1187和Mb2974)及M.acridum(Mac324)等绿僵菌均能定殖玉米根部，菌株Mb820、Ma939对玉米幼苗叶片发育增效最高达42.8%，Mr23对玉米茎秆生长增效最高达15.7%[20]。Sasan和Bidochka等发现罗伯茨绿僵菌能够定殖于柳枝稷草和扁豆植株中，并表现出促进根毛的生长作用[21]。此外，近几年来，金龟子绿僵菌与昆虫及植物宿主互作关系的相关研究已成为昆虫病原真菌开发应用研究领域的新方向。目前，已初步探明金龟子绿僵菌能定殖于植物根部[19]，还可利用植物根部分泌的蔗糖和棉籽糖等多糖类碳源物质营腐生生活[18]。
2.2 提升植物的抗虫性
现有研究表明，许多昆虫病原真菌可提升植物的抗虫性。如Quesada-Moraga等从罂粟瘿蜂(Iraellaluteipes)幼虫体内分离出一株球孢白僵菌，并通过种子处理成功定殖于罂粟中，定殖后的植株表现出一定的抗虫性[22]。此外，孙艺昕等报道4株玉米内生真菌(一株为白僵菌)可影响玉米蚜的生长发育，且具有趋避作用[23]。绿僵菌作为真菌，也具有提升宿主作物抗虫性的作用。Liao等报道金龟子绿僵菌在与宿主植物共生期间，可杀死取食根部的害虫并转移氮素给植株以维系自身的养分来源，或通过分泌植物发育必需的某些生长激素(如IAA)激活植物免疫系统，提高对病虫害的防御等途径促进宿主植物的生长[24]。而Ahmad等报道玉米内生菌罗伯茨绿僵菌可促进玉米植株生长，抑制小地老虎(Agrotisipsilon)的发育和改变植物防御基因的表达[25]。综上所述，一些昆虫病原真菌绿僵菌在植物上定殖后，可在一定程度上提高植物的抗虫性。
2.3 直接杀虫功能
绿僵菌的杀虫功能及机理研究一直是绿僵菌相关研究的重点。绿僵菌可通过分生孢子对害虫进行触杀，且不同于必须通过摄入才能致病的细菌和病毒，绿僵菌通常只需通过穿透昆虫表皮层就可感染昆虫。因此，绿僵菌特别适合发展为生物农药，替代化学杀虫剂。相关杀虫机理研究表明，绿僵菌在识别到一种合适的昆虫寄主后，即可通过形成感染结构(附着胞)和分泌不同的特异性效应子穿透昆虫表皮层，然后通过产生芽生孢子和器官特异性效应子用于侵染昆虫的血腔[26]。绿僵菌主要借用表皮层降解酶和机械压力分解穿透和同化昆虫的表皮层，同时克服侵染过程中遇到的障碍[27]。绿僵菌一旦到达血腔就会成功获得营养物质和避免能够吞噬和包裹入侵微生物的抗菌蛋白和循环细胞(血细胞)而进行繁殖[28]。一旦寄主死亡后绿僵菌就会从内到外破坏角质层产生分生孢子，之后在传播过程中开始新的感染。
在自然界中绿僵菌会与整个寄主植物根际相关的微生物群相互作用，包括作为促进生长的根际细菌或真菌生防菌等有益微生物[29]。如某些木霉(Trichodermaspp.)种类产生的SM(6-pentyl-alpha-pyrone，peptaibols，harzianum A and aspinolides)可诱发植物防御病害，同时对植物的生长和发育也具有积极的影响[30]。绿僵菌与木霉存在相关性[31]，且有研究表明，它们在对植物的作用中存在共性：M.robertsii绿僵菌和根际生防真菌木霉(T.virens)都能进行蔗糖代谢和控制根系定殖[18]。然而，绿僵菌和木霉在寄主根系定殖的机制存在差异[32]。
同时，有研究表明绿僵菌与植物、昆虫之间的联系主要是在营养的基础之上，它们三者的关系是互惠互利、相互依存的。此外，植物可以昆虫作为氮的来源[33]，如猪笼草在充满液体的深腔中诱捕昆虫后可获得氮源，昆虫产生的氮可占植物氮含量的70%[34]。绿僵菌还可以寄生并杀死土壤中的昆虫，然后将昆虫产生的氮转移到植物中供植物生长利用[35]。同样植物的生长也有益于绿僵菌，植物可通过光合作用为绿僵菌提供碳[36]。这样绿僵菌从昆虫体内获得的氮源越多，宿主植物生长的就越茂盛，从而回馈越多的碳源给绿僵菌，最终形成一种互惠互利的稳定关系：生长旺盛的植物可为绿僵菌提供更大更稳定的栖息地，同时绿僵菌的寄生可以进一步滋养和保护植物。因而通过根施、浸根或浇灌等方法将绿僵菌施用于土壤，不但有利于绿僵菌的生存，而且还可有效防治地下害虫、促进植物生长，同时对植株上害虫的防治亦具有良好的效果，可做到“一菌多用”。
绿僵菌目前作为杀虫剂已在世界各地得到广泛应用。在世界上最成功的生物控制项目之一就是在巴西每年使用金龟子绿僵菌防治200万hm2的甘蔗田害虫沫蝉[37]。但是，绿僵菌使用的最大限制是杀虫效率慢，虽然这有利于绿僵菌从害虫体内获取营养。此外，绿僵菌同样也具有其他微生物农药无法避免的问题。如Nahar等研究证明绿僵菌在继代培养几代后，其ITS序列并没有任何变化，但是毒力却出现下降，表明绿僵菌对害虫毒力的稳定性对于绿僵菌商品化至关重要[38]。绿僵菌在使用时还存在其它一些缺陷，主要表现在：效果较缓慢，作用成分复杂，有害生物控制范围较窄，易受环境因素的影响，产品有效期短、质量稳定性较差。目前，随着分子生物技术的快速发展，通过组成性表达绿僵菌毒力基因提高杀虫活性或者将外源毒素基因导入绿僵菌并获得超表达，从而克服了这些缺陷并提高了绿僵菌杀虫效率。如郭冰峰先后进行了多种与绿僵菌毒力相关的基因的克隆和功能分析研究[39]。此外，CRISPR/Cas9基因编辑技术也可以应用于昆虫病原真菌绿僵菌中[40]。另外，还可以将绿僵菌与其他低毒高效的化学农药或者一些植物源药剂混合使用，降低田间环境因素的干扰。如研究表明绿僵菌与多种化学药剂具有良好的相容性，可与多种化学农药甚至寄生蜂等协同作用而达到增效的效果[41-42]。
绿僵菌作为重要的生物杀虫剂之一，在害虫的绿色防控中占据十分重要的地位。将绿僵菌通过种衣，根施、浸根和浇灌等方式带入土壤，不仅对地下害虫具有良好的防控作用，而且可以促进农作物的生长发育，提高农作物的抗病虫能力。此外，部分内生绿僵菌还表现对某些植物病原微生物具有拮抗作用，比如Ramanpreet等发现罗伯茨绿僵菌对豆科植物病原菌枯萎病菌具有一定的拮抗作用[43]。其次，绿僵菌具有多功能的生活方式，除了寄生昆虫之外还可以营腐生生活，在适宜的条件下能够大量的繁殖，持续控制害虫。此外，土壤的存在对绿僵菌具有一定的保护作用，如可防止紫外线的伤害和温度的急剧变化[44-45]。总之，植物内生绿僵菌对于农作物的生长发育和害虫的绿色防控具有极大的挖掘与开发潜力。
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