【www.zhangdahai.com--其他范文】
赵琼瑜 胡 鉴 陈雨欣 李彩燕 宋 伟
胶原蛋白是一种最为常见，具有特殊三螺旋结构的细胞外基质蛋白质，主要分布于动物的皮肤、骨和其他器官之中，在维持组织稳态、生物完整性和结构力学中起关键作用[1]。而其生产来源主要依赖于陆生动物(主要为猪和牛)。由于陆源性胶原蛋白受价格过高、宗教信仰和一些人或者地区的风俗习惯等因素的制约，且水产胶原蛋白因其丰富的来源和相较于陆生动物源胶原蛋白良好的生化性能和独特的优点被广泛研究[1-3]。
水产品深加工技术的不断发展促进了对胶原蛋白的研究与探索[4]。水产品加工过程中会产生大量副产物，包括骨头、鳞片和体壁等骨源性副产物，这些副产物富含胶原蛋白，是提取胶原蛋白的优良原材料[5-7]。目前已从多种水产动物的骨源性材料(如鱼鳞[8]、鱼骨[9]和龟甲[10]等)中提取获得胶原蛋白，但其提取率或得率不高，不能满足产业化需求。这主要由于骨源性材料含有大量的磷酸钙和羟基磷灰石，羟基磷灰石与胶原纤维结合，形成坚硬难溶的骨盐沉积在胶原表面，影响胶原蛋白的溶出[11]。目前常见的脱钙方法有盐酸法、柠檬酸法和EDTA法。EDTA价格昂贵，无法实现工业化脱钙；
柠檬酸的脱钙效果较好，但会导致胶原蛋白易溶出[12-13]。而盐酸不仅价格便宜，还具有操作简单、脱钙效率高等优点。因此，盐酸常被作为水生动物骨源材料的脱钙试剂[14-16]。
中华鳖(Pelodiscussinensis)是中国重要的淡水经济动物，食药用价值高。鳖甲来源于鳖科动物的背甲，含有丰富的胶原蛋白、钙和微量元素等营养成分[17]，是用于提取胶原蛋白的优质来源。鳖甲中胶原蛋白纤维与羟基磷酸钙粘附紧密，胶原蛋白很难溶出，为提高胶原蛋白溶出率需对鳖甲进行脱钙处理。目前大部分的胶原蛋白脱钙研究只是以钙质的去除量为评价指标，无法判定胶原蛋白的损失量，即所得的脱钙工艺具有局限性[18]。研究拟以鳖甲为原料，采用盐酸脱钙法，综合探究盐酸浓度、料液比、脱钙时间和脱钙温度4个因素对中华鳖背甲脱钙率和胶原蛋白迁出率的影响，并通过正交试验对鳖甲脱钙进行优化分析。同时，鳖甲经脱钙处理后，采用乙酸法制备鳖甲胶原蛋白，利用紫外全波长扫描、傅里叶变换红外光谱扫描和圆二色光谱扫描分析胶原蛋白的三螺旋结构，利用SDS-PAGE凝胶电泳和氨基酸分析对胶原蛋白的亚基和氨基酸成分进行比较，旨在进一步深入研究和开发中华鳖的鳖甲资源，以期为鳖甲胶原蛋白的提取提供依据。
1.1 材料与试剂
中华鳖：市售；
SDS-PAGE试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；
碳酸钙、浓盐酸、硝酸、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、无水乙酸钠、氢氧化钠、柠檬酸、钙红指示剂、硫化钠、L-羟脯氨酸标准品、对二甲氨基苯甲醛、氯胺T等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；
试验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
傅里叶红外扫描仪：VERTEX 70型，德国BRUKER OPTICS 公司；
全自动氨基酸分析仪：L8900型，日本HITACH公司；
冷冻干燥机：ALPHA 2-4 LD plus型，德国Christ公司；
紫外分光光度计：Cary-100型，美国Agilent Technologies公司；
精密鼓风干燥箱：BPG-9140A型，上海一恒科学仪器有限公司；
电子分析天平：ME204型，美国METTLER TOLEDO公司；
pH计：S220-K型，美国METTLER TOLEDO公司；
落地大容量离心机：LYNX6000型，美国Thermo Scientific Fisher公司。
1.3 试验方法
1.3.1 中华鳖背甲预处理 中华鳖宰杀后，迅速剥离其背甲，精细剔除背甲上的肌肉后，于-20 ℃冷冻2 h，粉碎，冷冻干燥，粉碎，4 ℃保存备用。
1.3.2 鳖甲中总钙含量测定
(1) 钙离子标准曲线绘制：参照侯风萍等[19]的方法略作改动。精确吸取0，1，2，3，4，5 mL钙标准液(100 mg/L 碳酸钙)，用蒸馏水定容至10 mL，用胶头滴管滴加1滴硫化钠溶液(10 g/L)和0.10 mL柠檬酸钠溶液(0.05 mol/L)，用氢氧化钾溶液(1.25 mol/L)调节pH值至12～13，加3～5滴钙红指示剂，立即用EDTA溶液滴定，直至瓶中溶液由紫红色变为亮蓝色，平行滴定3组。以钙离子浓度为纵坐标，EDTA消耗体积为横坐标，得钙标准曲线方程y=0.044x-0.007 8，R2= 0.993。
(2) 鳖甲中总钙含量测定：根据GB 5009.4—2016，并按式(1)计算总钙含量。
(1)
式中：
c1——总钙含量，mg/mL；
c2——钙离子质量浓度，mg/mL；
V1——溶解液体积，mL；
n1——稀释倍数；
m1——总灰分质量，g；
m2——灰分质量，g；
m3——样品质量，g。
1.3.3 单因素试验 以盐酸作为溶媒，参照周如意等[15-16]的方法并略作改动。初设条件为盐酸浓度0.8 mol/L，温度25 ℃，料液比1∶20 (g/mL)，脱钙时间2 h。在此基础上设置不同盐酸浓度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mol/L)、脱钙时间(1，2，3，4，5，6，8 h)、脱钙温度(5，10，15，25，30，35 ℃)和料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]4个因素进行优化试验，以脱钙率和胶原蛋白回收率为评价指标。
1.3.4 正交试验设计 根据单因素试验结果和显著性差异分析从脱钙温度、脱钙时间、料液比和盐酸浓度4个因素中筛选出显著影响脱钙效果的3个因素(盐酸浓度、温度、料液比)作为试验因子，采用Design-Expert软件设计L9(33)正交试验，以脱钙率和胶原蛋白回收率为评价指标，每组平行3次，优化中华鳖背甲脱钙工艺。
1.3.5 脱钙液中钙含量测定 分别精确吸取1.0 mL脱钙液样品，用EDTA络合滴定法进行钙含量测定，平行滴定3组，按式(2)计算脱钙液中钙含量。
(2)
式中：
A——脱钙率，%；
V2——脱钙液体积，mL；
n2——滴定稀释倍数；
m4——背甲质量，g。
1.3.6 胶原蛋白含量测定 参照陆剑锋等[20]的方法并略作改动。精确吸取0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL羟脯氨酸标准应用液(6.40 μg/mL)于10 mL具塞比色管中，分别依次加入蒸馏水2.50，2.00，1.50，1.00，0.50，0.00 mL，分别加入2 mL异丙醇、1 mL氯胺T氧化剂，摇匀，放置4 min。分别依次加入2 mL对二甲氨基苯甲醛显色剂(1 g/mL)，加塞摇匀，60 ℃水浴20 min，冷却，测定560 nm处吸光度，绘制标准曲线方程为y=0.149 1x-0.001 8，R2=0.995。
精确吸取5 mL脱钙液于25 mL具塞比色管中，加入5 mL浓盐酸，氮吹后封口。110 ℃烘箱中水解24 h，水解液用NaOH溶液调节pH至4～6，用蒸馏水定容至25 mL。取上述溶液2.5 mL加入2 mL异丙醇和1 mL氧化剂，摇匀，放置4 min，加入2 mL显色剂，摇匀，60 ℃水浴20 min，冷却，测定560 nm处吸光值。按式(3)、式(4) 计算脱钙液中胶原蛋白含量和胶原蛋白回收率。
G1=c3×n3×V2×11.1×106,
(3)
(4)
式中：
G1——脱钙液中胶原蛋白含量，g；
c3——羟脯氨酸质量浓度，μg/mL；
n3——胶原测定稀释倍数；
11.1——胶原蛋白水解为羟脯氨酸的系数；
B——胶原蛋白回收率，%；
G2——中华鳖背甲中胶原蛋白含量，g。
1.3.7 鳖甲胶原蛋白的制备 参照张强等[21]的方法并略作修改。称取一定量中华鳖背甲脱钙样品与未脱钙鳖甲样品，以料液比1∶10 (g/mL)加入0.5 mol/L的乙酸混匀，搅拌浸提24 h，8 000 r/min离心15 min，取上清液进行透析，直至样品溶液pH为7，冻干，于4 ℃保存备用。
1.3.8 脱钙前后胶原蛋白结构特性测定
(1) SDS-PAGE分析：参照张强等[21-22]的方法稍作修改。分别精确称取一定量的脱钙处理鳖甲胶原蛋白和未脱钙处理鳖甲胶原蛋白，分别溶于0.05 mol/L乙酸溶液中，制成终质量浓度为30 mg/mL胶原蛋白溶解液。以体积比1∶4与上样缓冲液混合，沸水浴5 min，冷却后短时离心，收集上清液，与蛋白Marker一同上样，100 V恒流下进行电泳。
(2) 紫外全波长扫描(UV)分析：根据蔡路昀等[22]的方法略作修改。取适量样品溶解于0.05 mol/L乙酸溶液中制成5 mg/mL胶原溶液，以0.05 mol/L乙酸溶液作空白对照，于190～400 nm区间内进行扫描。
(3) 傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析：参照蔡路昀等[22]的方法，利用锡探针于400～4 000 cm-1区间内进行吸收波谱扫描。
(4) 氨基酸组成分析：参照张强等[21]的方法略作修改。准确称取1 g样品于25 mL具塞比色皿管中，加入10 mL 6 mol/L优级盐酸、氮吹后封口，110 ℃消解24 h，过滤，用去离子水定容，取0.2 mL进行氮吹至干，加入0.02 mol/L 的盐酸2 mL，用0.22 μm滤膜过滤，用全自动氨基酸分析仪进行测定。
1.3.9 数据统计与分析 试验数据以平均数±标准差表示。采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比较法进行显著性检验(P<0.05)；
应用Graphpad prism 8.0进行数据整理并作图。
2.1 鳖甲脱钙单因素试验
2.1.1 盐酸浓度 由图1可知，随着盐酸浓度的增加，鳖甲中钙的脱除率呈上升趋势，胶原蛋白回收率呈下降趋势。当盐酸浓度为0.8 mol/L时，脱钙率最高达59.16%，此时胶原蛋白回收率为95.89%。之后随着盐酸浓度的增加，脱钙率趋于平缓并略有下降，胶原蛋白回收率急剧下降(P<0.05)，可能是由于加入盐酸，样品溶胀增强，结构蓬松程度增加，利于钙离子的溶出；
而羟基磷灰石的量是一定的，加入足够多的盐酸相互反应后，当羟基磷灰石反应基本完全，再增加盐酸也不能溶出更多的钙[23]。并且过度地增加酸浓度，反而会使大分子物质(如胶原蛋白和其他蛋白)溶出增加，进而影响钙离子的溶出，同时高浓度盐酸也会破坏胶原蛋白结构[1]。故选取盐酸浓度为0.7～0.9 mol/L用于进一步优化试验。
2.1.2 脱钙时间 由图2可知，随着脱钙时间的延长，鳖甲中钙离子脱除率呈短时间(1.0～2.0 h)上升后趋于平缓的趋势，胶原蛋白回收率呈下降趋势。当脱钙时间为2.0 h时，脱钙率达最高为62.03%，此时胶原蛋白回收率为95.55%。之后随着酸泡时间的继续增加，脱钙率变化不显著。这可能是在进行反应的同时，盐酸不断地挥发,导致反应系统中盐酸的实际浓度下降，不利于可溶性钙的提取[23]。因此，选择2 h作为中华鳖背甲适宜脱钙时间。
小写字母不同代表组间胶原蛋白回收率差异显著(P<0.05)；
大写字母不同代表组间脱钙率差异显著(P<0.05)图1 盐酸浓度对中华鳖背甲脱钙效果的影响Figure 1 Effects of HCl concentration on Ca2+ removal rate of the Chinese soft-shelled turtle carapace
小写字母不同代表组间胶原蛋白回收率差异显著(P<0.05)；
大写字母不同代表组间脱钙率差异显著(P<0.05)图2 脱钙时间对中华鳖背甲脱钙效果的影响Figure 2 Effects of time on Ca2+ removal rate of the Chinese soft-shelled turtle carapace
2.1.3 脱钙温度 由图3可知，随着脱钙温度的升高，鳖甲中钙离子脱除率逐渐增大，胶原蛋白回收率随脱钙温度的升高呈下降趋势。当脱钙温度为25 ℃时，脱钙率达最大值为62.69%，此时胶原蛋白回收率为94.09%。低温时，钙离子溶解度较低，渗透性较弱，胶原蛋白大分子物质更不易渗透。随着脱钙温度的升高，分子运动加剧，使其溶解度增大，但随着脱钙温度的升高，盐酸挥发，导致浓度下降，影响钙的脱除率[23-24]。因此，选取脱钙温度为22～28 ℃用于进一步优化试验。
2.1.4 料液比 由图4可知，随着鳖甲与盐酸溶液比例的增大，钙离子脱除率呈递增的趋势，胶原蛋白回收率随脱钙温度的升高呈下降趋势。当料液比为1∶25 (g/mL)时，钙脱除率不再增加，反而稍有下降，胶原蛋白回收率则大幅下降。一定质量的鳖甲中钙含量是有限的，盐酸溶液体积的增大利于钙的溶出。当脱钙剂用量继续增加时，脱钙率略有降低，表明钙离子已基本从组织中充分溶出。脱钙剂过剩，不但会影响脱钙效果，还会导致胶原蛋白的溶出量增加，回收率降低[24]。故选择料液比为1∶22.5～1∶27.5 (g/mL)用于进一步优化试验。
小写字母不同代表组间胶原蛋白回收率差异显著(P<0.05)；
大写字母不同代表组间脱钙率差异显著(P<0.05)图3 脱钙温度对中华鳖背甲脱钙效果的影响Figure 3 Effects of temperature on Ca2+ removal rate of the Chinese soft-shelled turtle carapace
小写字母不同代表组间胶原蛋白回收率差异显著(P<0.05)；
大写字母不同代表组间脱钙率差异显著(P<0.05)图4 料液比对中华鳖背甲脱钙效果的影响Figure 4 Effects of solid-liquid ratio on Ca2+ removal rate of the Chinese soft-shelled turtle carapace
2.2 正交试验
正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。由表2、表3可知，各因素对鳖甲脱钙率的影响主次顺序为盐酸浓度>脱钙温度>料液比。在胶原蛋白回收率方面，脱钙温度的影响最大，盐酸浓度的最小。结合k值可知，以脱钙率和胶原蛋白回收率为考察指标的最佳工艺组合分别为A2B3C2和A1B1C3。根据各因素对脱钙率和胶原蛋白回收率的影响大小，最后选择A2B3C2作为鳖甲脱钙的最佳工艺，即盐酸浓度0.8 mol/L、脱钙温度28 ℃、料液比1∶25 (g/mL)和脱钙时间2 h，此时脱钙率和胶原蛋白回收率分别为(67.35±0.92)%和(90.77±1.08)%，说明该正交优化试验所得最佳工艺组合可以有效脱钙，并且能较大程度地减少胶原蛋白的流失。
2.3 鳖甲胶原蛋白含量与胶原蛋白提取率
由图5可知，未脱钙处理鳖甲和脱钙处理后鳖甲中胶原蛋白含量分别为62.27，142.18 mg/g，脱钙处理后样品中的胶原蛋白含量约为未脱钙的2.3倍，差异显著(P<0.05)。未脱钙处理鳖甲和脱钙处理后鳖甲中胶原蛋白提取率分别为16.07%，66.95%，脱钙处理后样品的胶原蛋白提取率约为未脱钙的4.2倍，差异显著(P<0.05)，可能因为鳖甲经脱钙处理后，钙离子减少，组织结构疏松，胶原蛋白表面积增加，利于胶原蛋白与提取液接触，增加胶原的溶胀，进而促使胶原蛋白溶出[25]。
表1 正交试验因素水平表Table 1 Codes and levels of test factors in orthogonal design
表2 中华鳖背甲脱钙正交试验结果及极差分析Table 2 L9(33) orthogonal design and statistical analysis
表3 正交试验结果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results
**代表组间差异极显著(P<0.01)图5 脱钙处理对鳖甲中胶原蛋白含量和胶原蛋白提取率的影响Figure 5 Effects of decalcification on collagen contents and extraction yield of collagen in the Chinese soft-shelled turtle carapace
2.4 鳖甲胶原蛋白结构特性分析
2.4.1 SDS-PAGE 由图6可知，两种胶原蛋白均含有4条明显的肽链，即α1、α2、β和γ链，表明提取的胶原蛋白质属于典型的Ⅰ型胶原蛋白质。α1和α2链的相对分子质量在100～135 kDa，二聚体β-链和三聚体γ-链相对分子量为245 kDa左右，符合大多数水生胶原蛋白的结构特征[20-22,26]。
1. 未脱钙处理鳖甲胶原蛋白 2. 脱钙处理鳖甲胶原蛋白图6 鳖甲胶原蛋白SDS-PAGE电泳图Figure 6 SDS-PAGE electrophoresis of collagen in the Chinese soft-shelled turtle carapace
图7 鳖甲胶原蛋白紫外吸收光谱图Figure 7 UV absorption spectra of collagen in the Chinese soft-shelled turtle carapace
。
2.4.3 傅里叶变换红外光谱(FTIR) 由图8可知，在酰胺I(特征吸收范围位于1 600～1 700 cm-1)、II(特征吸收范围为1 500～1 600 cm-1)、III(特征吸收范围为1 200～1 360 cm-1)以及A(特征吸收范围为3 200～3 400 cm-1)、B带(特征吸收峰位于2 920 cm-1附近)均可观察到明显的特征峰，符合胶原蛋白质的特征吸收峰[22]，说明所提胶原蛋白具有较完整的三螺旋结构。
1. 胶原蛋白标准品 2. 未脱钙处理鳖甲胶原蛋白 3. 脱钙处理背甲胶原蛋白图8 鳖甲胶原蛋白红外吸收光谱图Figure 8 Infrared absorption spectra of collagen in the Chinese soft-shelled turtle carapace
2.4.4 氨基酸组成 由表4可知，鳖甲胶原蛋白中氨基酸种类和含量相对丰富，其中甘氨酸含量最高，占总氨基酸含量的1/3；
其次是亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)，约占总氨基酸含量的1/5；
丙氨酸和谷氨酸含量也较多，约占总氨基酸含量的1/10；
不含色氨酸，只有极少量的苯丙氨酸和半胱氨酸。氨基酸分析结果符合胶原蛋白的氨基酸组成特征[21,26,28]。两种胶原蛋白的氨基酸种类一致而含量有所差异，与紫外扫描图谱结果分析一致。这可能是由于盐酸破坏了部分氨基酸的结构，使含量发生了变化[27]。
表4 鳖甲胶原蛋白氨基酸组成Table 4 Amino acid compositions of collagen in the Chinese soft-shelled turtle carapaceresidues
酸法脱除鳖甲中钙的最佳工艺条件为盐酸浓度0.8 mol/L、料液比1∶25 (g/mL)、脱钙温度28 ℃、脱钙时间2 h。此条件下脱钙率和胶原蛋白回收率分别为(67.35±0.92)%和(90.77±1.08)%。相同提取条件下，脱钙处理后的鳖甲样品胶原蛋白含量和提取率显著高于未脱钙鳖甲的，且脱钙处理后制备的鳖甲胶原蛋白提取率高、纯度较高，三螺旋结构完整。后续可进一步通过其他辅助脱钙处理方法提高脱钙率以及降低胶原蛋白损失率。
猜你喜欢 鳖甲胶原蛋白盐酸 盐酸泄漏环球时报(2022-05-18)2022-05-18HPLC法测定盐酸伐地那非的杂质含量中国药学药品知识仓库(2022年8期)2022-05-09盐酸氨溴索联合抗生素在慢性支气管炎治疗中的作用分析中国典型病例大全(2022年9期)2022-04-19盐酸氨溴索在慢阻肺合并肺部感染的临床应用中国典型病例大全(2022年9期)2022-04-19软坚散结说鳖甲养生月刊(2022年1期)2022-01-12美容养颜？胶原蛋白到底怎么选？消费者报道(2019年6期)2019-08-17想不到你是这样的胶原蛋白Coco薇(2017年12期)2018-01-03根本没有植物胶原蛋白！饮食与健康·下旬刊(2017年3期)2017-03-30治早期肝硬化妇女生活(2016年12期)2016-12-13自拟葛根鳖甲汤治疗急慢性咽炎咽喉疼痛76例临床观察中国民族民间医药·下半月(2014年2期)2014-09-26本文来源：http://www.zhangdahai.com/shiyongfanwen/qitafanwen/2023/0607/608328.html
