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陆春宇，狄义宁，黎青虹，刘 涵，刘鲁峰，何丽莲, ，李富生,,3
(1.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；
2.云南农业大学 甘蔗研究所，云南 昆明 650201；
3.云南省作物生产与智慧农业重点实验室，云南 昆明 650201)
甘蔗(Saccharum officinarumL.)是制糖、乙醇和甜味剂的主要原料，同时也是世界上最重要的经济能源作物之一[1]，中国每年以甘蔗制作的糖占中国食糖总产量的80%以上[2]。近年来，因追求甘蔗增产而过度使用化肥和农药导致甘蔗产区环境污染的现象日益突出，如何保证甘蔗产量并减少环境污染成了亟待解决的问题。针对这一情况，有学者试图通过微生物菌剂的开发与利用解决该问题，其中甘蔗内生菌作为一类特殊的微生物群体受到广泛关注。自1993 年DÖBEREINER等[3]提出“diazotrophic endophytes”一词后，大量甘蔗内生菌被分离并报道，其主要类群有固氮螺菌属(Azospirillum)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)和芽孢杆菌属(Bacillus)[4]。
芽孢杆菌(Bacillusspp.)是一类好氧或兼性厌氧、形如杆状的革兰氏阳性细菌。它不仅对人畜无害、不污染环境、繁殖速度快，而且生理活性强[5]，是植物内生菌中应用价值广泛的一大类细菌，常用于开发各类功能的微生物菌剂，近年来受到学者的广泛关注。常华瑜等[6]发现内生芽孢杆菌对植物病原菌有很强的抑制作用，同时对宿主植物具有较好的促进生长作用；
龚国利等[7]发现多数内生芽孢杆菌的代谢产物有利于宿主生长，具有广谱抑菌能力，可在农作物生物防治和环境修复等方面发挥重要作用。在研究芽孢杆菌对病原菌抗病活性测定试验中，通常以分泌嗜铁素含量作为评价其具有抗病活性的重要指标。研究发现：内生芽孢杆菌产生的嗜铁素比真菌产生的嗜铁素对铁元素的亲和力强。因此，利用植物内生芽孢杆菌所产生的铁载体与病原真菌争夺生存所需的铁离子，可降低病原菌种群数量，间接帮助宿主植物抵御病害侵染[8]。内生芽孢杆菌还具有溶解磷酸盐的作用，可为宿主植物增加矿质元素的吸收，进而促进植物体内的能量传递、细胞分裂和物质运转以及根系发育，提高植物的整体抗逆性。此外，内生芽孢杆菌还能产生几丁质酶和纤维素酶，以降解病原真菌细胞壁的几丁质和纤维素，瓦解病原菌细胞壁结构致其死亡从而起到抑菌作用[9]。
本研究以前期分离储存的3 株甘蔗内生芽孢杆菌为研究对象，进行广谱抑菌活性与促生能力分析、生理生化检测与分子生物学相关鉴定，以期为甘蔗微生物肥料的开发提供菌株材料，也为同类研究提供一定的参考与借鉴。
1.1 试验材料
1.1.1 供试甘蔗内生芽孢杆菌
菌株P8 和Q2 分离自云南农业大学甘蔗资源圃中的栽培种闽糖69-421 的根，菌株P7 分离自栽培种滇蔗01-58 的茎。
1.1.2 供试病原菌
供试甘蔗梢腐病病原菌串珠镰刀菌(Fusari-um moniliforme)分离自云南农业大学甘蔗研究所资源圃；
烟草炭疽病病原菌(Colletotrichum micotianaeAverna)、玉米纹枯病病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷茎腐病病原菌禾谷镰孢菌(F.graminearum)、玉米大斑病病原菌大斑凸脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)和玉米小斑病病原菌玉蜀黍离蠕孢菌(Bipolaris maydis)均由云南农业大学植物保护学院生物防治实验室提供。
1.2 病原菌抑制能力与促生长抑菌指标的测定
1.2.1 菌株的活化
甘蔗内生芽孢杆菌的活化：用移液枪吸取约200 μL 甘油保存的菌液，接种至LB 液体培养基[10]后置于恒温摇床中，设置温度35 ℃、转速160 r/min 振荡培养48 h，用接种环沾取细菌培养液在LB 固体培养基上划线，置于35 ℃的恒温光照培养箱培养48 h。
供试病原菌的活化：用无菌镊子夹取滤纸保存的病原菌于PDA 培养基[10]，置于28 ℃恒温光照培养箱中培养。
1.2.2 广谱抑菌效果测定
采用平板对峙法[11]，用直径为5 mm 的打孔器在长满病原菌菌丝的PDA 培养基中打孔，将菌饼接入新的PDA 培养基中心。将活化后的甘蔗内生菌用接种环挑取菌落接种至距病原菌中心3 cm 处，处理重复3 次，以未接种内生芽孢杆菌为对照。置于28 ℃恒温光照培养箱中培养直至对照病原菌长满平板后，采用十字交叉法测量对照组半径和处理组半径，并根据公式计算其抑菌率：抑菌率=[(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径 ]×100%。
1.2.3 菌株产嗜铁素能力的测定
采用CAS 平板法[12]测定嗜铁素活性。将活化的内生菌株接种至CAS 培养基，在28 ℃下恒温培养3 d，观察内生菌株是否能正常生长，并记录菌落直径(d)以及周围产生的黄色透明光圈直径(D)，计算可溶性指数(D/d)。可溶性指数值越大，表明菌株嗜铁素合成能力越强。
采用王平等[13]的方法测定嗜铁素相对含量。将产生黄色透明光圈的菌株接种于装有50 mL MKB 液体培养基的100 mL 锥形瓶中，放置于恒温摇床中，设置温度28 ℃、转速180 r/min 培养7 d，吸取培养基置于10 000 r/min 离心机中离心10 min，取3 mL CAS 液体培养基与等量的上清液混合后，在黑暗条件下反应1 h，以不接菌株的MKB 作对照。用分光光度计在630 nm 处测定7 d 内各处理的OD 值，处理组和对照组的吸光度分别记为As 和Ar，计算嗜铁素的相对含量(As/Ar)。As/Ar 值越小，菌株合成嗜铁素的能力越强。
1.2.4 菌株溶磷能力的测定
采用平板溶磷圈法[14-15]，将菌株接种至植酸钙和NBRIP 固体培养基中，在28 ℃下恒温培养7 d 后观察内生菌株是否能正常生长，并记录菌落直径(d)以及周围产生的透明光圈直径(D)，计算可溶性指数(D/d)。可溶性指数值越大，表明菌株对磷的利用能力越强。
可溶性磷含量的测定：将产生透明圈的菌株分别接种于植酸钙和NBRIP 液体培养基中，以不接菌的空白培养基为对照，在28 ℃、160 r/min条件下振荡培养9 d 后采用钼蓝法测定菌株溶磷量[16]。测定1～9 d 培养液在850 nm 处的OD 值，根据磷标准曲线公式计算菌株可溶性磷含量。
磷标准曲线的绘制：配置1 mol/L K2HPO4溶液，加入去离子水稀释成梯度为200、400、600、800 和1 000 μmol/L 的溶液。各梯度加入钼蓝法配置的染液[16]，室温条件染色30 min，测定其在850 nm 处的OD 值。以吸光度为纵坐标、磷浓度为横坐标，绘制磷标准曲线。
1.2.5 菌株纤维素酶活性测定
采用刚果红平板法[17]。将各菌株接种于CMCNa 培养基中，每个平板接种3 个区域，在28 ℃恒温培养箱中培养3 d，用1 mg/mL 刚果红溶液染色1 h 后，加入浓度为1 mol/L 的氯化钠溶液脱色。观察菌株是否能正常生长，并记录菌落直径(d)以及周围产生的黄色透明光圈直径(D)，计算可溶性指数(D/d)。可溶性指数值越大，表明菌株的纤维素酶活性越强。
采用吴静[18]的方法进一步测定各菌株的酶活性。将各菌株接种于装有50 mL CMC-Na 液体培养基的100 mL 三角瓶中，在28 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 d。取培养液在室温条件下12 000 r/min 离心10 min，取0.5 mL 上清液于50 mL离心管中，加入1 mL CMC-Na 柠檬酸溶液混合，在50 ℃水浴锅中加热30 min，之后加入3 mL DNS 染色液混合后置于沸水加热10 min，冷却后加入纯水补至25 mL，测定540 nm 处的OD 值。
1.2.6 优良抑菌指标菌株的鉴定
生理生化特征鉴定：参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[19]测定菌株的硝酸还原酶活性、淀粉水解、V-P 显色、接触酶试验、明胶液化和革兰氏染色等生理生化特征。
分子生物学鉴定：采用CHENG 等[20]的分子生物学鉴定方法提取内生细菌DNA。提取16S rRNA 与GyrA基因片段，16S rRNA 基因片段采用通用引物27F：5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3"和1492R：5"-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3"、GyrA基因片段引物采用GyrA-F：5"-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3"和GyrAR：5"-CAAGGTAATGCTCC AGGCATTGCT-3"进行PCR 扩增[21]。将扩增产物电泳分离回收后交由北京擎科生物科技有限公司进行测序，所获得的序列在NCBI 网站上使用BLAST 软件进行同源性比对，之后采用MEGA 7.0 的邻接法构建系统发育树。
1.2.7 生长曲线测定
将优良抑菌指标的菌株接种于LB 液体培养基中，在35 ℃、180 r/min 条件下培养，在接种菌株后的第2、4、6、12、24、36、48、60 和72 小时分别取样，使用紫外光分光光度计测定600 nm 处的OD 值。
2.1 广谱抑菌效果
由表1 可知：在3 株内生芽孢杆菌中，菌株Q2 对6 个供试病原菌都有很好的抑制效果，其中对玉米小斑病病原菌玉蜀黍离蠕孢菌的抑制率达到81.6%，对其余病原菌的抑制率均大于61%。菌株P8 对6 个供试病原菌的抑制率均大于67%，其中对禾谷茎腐病病原菌禾谷镰孢菌的抑制率达到79.96%。菌株P7 对6 个病原菌的抑制率在60.64%～67.91%，总体弱于菌株Q2 和P8。
表1 内生菌对6 株供试病原菌的抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of endophytic strains against six pathogenic fungi
2.2 嗜铁素合成能力的测定
由表2 可知：3 株菌在CAS 平板上都能生长并产生黄色透明圈，其直径大小排序为Q2＞P7＞P8；
由可溶性指数可知：各菌株产生嗜铁素能力大小排序为Q2＞P8＞P7。经过试验初步判断，3 株菌都具有产嗜铁素的能力，需要测定各菌株的嗜铁素相对含量，以进一步比较3 株内生芽孢杆菌产嗜铁素能力。
表2 CAS 平板测定菌株合成嗜铁素的能力Tab.2 Determination of ferriphiles by CAS medium
由图1 可知：培养3 d 时菌株Q2 的As/Ar值最低，仅为0.34，故Q2 在3 株菌中的嗜铁素相对含量最高；
培养7 d 时菌株P8 的As/Ar 值为0.36，仅次于Q2；
培养2 d 时菌株P7 的As/Ar 值为0.64，在3 株菌中嗜铁素相对含量最低。因此，3 株菌的嗜铁素合成能力强弱排序为Q2＞P8＞P7。
图1 嗜铁素相对含量的测定Fig.1 Determination of relative ferritin content
2.3 溶磷能力的测定
由表3 可知：3 株菌在NBRIP 培养基上对无机磷的利用能力(可溶性指数)强弱排序为Q2＞P8＞P7，在植酸钙培养基上对有机磷的利用能力(可溶性指数)强弱排序为P7＞P8＞Q2。可见，菌株Q2 对无机磷的利用能力强于菌株P7 和P8，而菌株P7 对有机磷的利用能力强于菌株Q2 和P8。经过初步比较，3 株内生芽孢杆菌对磷酸盐的利用能力相差不大，需测定各菌株的可溶性磷含量，以进一步比较3 株内生芽孢杆菌的溶磷能力。
表3 菌株溶磷能力的定性测定Tab.3 Qualitative determination of phosphorus dissolving ability of strains
由图2a 可知：在NBRIP 液体培养基中，菌株Q2 的可溶性磷含量在培养期间逐渐上升，第9 天时最高(166.95 mg/L)；
菌株P7 的可溶性磷含量呈先上升后下降最后略微上升的趋势，在培养2 d 时最高(51.82 mg/L)；
菌株P8 的可溶性磷含量总体表现为先上升后下降最后趋于平稳的趋势，在培养2 d 时最高(45.91 mg/L)。可见，3 株菌在NBRIP 液体培养基对无机磷的利用能力强弱排序为Q2＞P7＞P8。由图2b 可知：在植酸钙液体培养基中，菌株P7 在培养1 d 时的可溶性磷含量最高(65.04 mg/L)，随后逐渐降低；
菌株Q2 在培养3 d 时的可溶性磷含量最高(41.47 mg/L)，随后趋于平稳；
菌株P8 在培养期间的可溶性磷含量较为平稳，培养6 d 时的含量最高(38.87 mg/L)。可见，3 株菌在植酸钙液体培养基对有机磷的利用能力强弱排序为P7＞Q2＞P8。
图2 菌株的可溶性磷含量Fig.2 Soluble phosphorus content of strains
2.4 羧甲基纤维素酶活性的测定
由表4 可知：3 株菌在CMC-Na 平板上对纤维素的降解能力(可溶性指数)强弱排序为Q2＞P8＞P7。将产生透明圈的菌株接种至CMC-Na 液体培养基培养3 d 后测定其酶活性，结果显示：菌株Q2、P8 和P7 的纤维素酶活性最大值分别为5.22、2.91 和1.60 U/mL，即：培养3 d 时各菌株的纤维素酶活性强弱排序为Q2＞P8＞P7。
表4 菌株在CMC-Na 培养基的生长Tab.4 Growth of the strain in CMC-Na medium
2.5 优良抑菌指标菌株的鉴定
经过广谱抑菌活性分析和抑菌活性指标的测定，发现菌株Q2 在促生长和抑菌活性指标方面尤为突出，对其进一步进行种属鉴定。
2.5.1 形态学和生理生化鉴定
Q2 在LB 培养基上的菌落形状为圆形，扁平，黄色，表面粗糙。经革兰氏染色后呈阳性。由表5 可知：菌株Q2 对明胶、靛基质、接触酶、硝酸盐还原和V-P 等试验为阳性，对淀粉水解试验为阴性。通过形态学和生理生化鉴定将该菌初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus)。
表5 生理生化鉴定结果Tab.5 Physiological and biochemical identification results
2.5.2 分子生物学鉴定结果
将菌株Q2 的16S rRNA 基因片段测序结果在 NCBI 上进行BLAST 同源性比对，结果显示：菌株 Q2 与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)以及贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)的同源性达99%。系统发育树(图3a)显示：Q2 与Bacillus subtilisstrain QH14-11 (MT0786 11.1)的距离最近。
将菌株Q2 的GyrA基因序列测序结果在NCBI 上进行BLAST 同源性比对，结果显示：菌株 Q2 与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的GyrA基因序列最为相似，同源性达 100%。系统发育树结果(图3b)显示：菌株Q2 与Bacillus subtilisstrain SF128 DNAGyrA基因 (LK936504.1)距离最近。综合上述结果，将菌株Q2 确定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
图3 Q2 菌株的16S rRNA 序列(a)和GyrA 序列(b)构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic trees constructed from 16S rRNA sequence (a) and GyrA sequence (b) of the strain Q2
2.6 菌株Q2 的生长曲线
由图4 可知：菌株Q2 在接种后4～12 h 生长最为迅速；
24～36 h 其生长速度减慢，活菌数量逐渐达到峰值；
36 h 后菌株开始衰退，培养液中活菌数逐渐减少。可见，菌株Q2 最具活力的时期为4～36 h。
图4 发酵液的吸光度随时间的变化趋势Fig.4 The change trend of the absorbance of fermentation broth with time
本研究比较了3 株内生芽孢杆菌对6 株供试病原菌的广谱抑菌效果，结果显示：菌株Q2 和P8 的抑菌效果相差不大，2 株菌的综合抑菌能力强于P7，其中Q2 对玉蜀黍离蠕孢菌(B.maydis)的抑制效果最佳，为81.60%。试验进一步测定了3 株菌的嗜铁素合成能力、溶磷能力和纤维素酶活性等促生长抑菌指标。
在嗜铁素合成能力方面，Q2 的嗜铁素合成能力强于P8 和P7，且明显强于P7。一般认为As/Ar 值低于0.5 的菌株嗜铁素合成能力较强[13]，如陈孝利[22]从紫花苜蓿分离的内生菌Y22 在培养2 d 后的As/Ar 值为0.521，而本研究菌株Q2 培养2 d 时的As/Ar 值为0.51，相比之下Q2 的嗜铁素合成能力略显优势；
培养3 d 时Q2 的As/Ar值达到0.34，因此，菌株Q2 在嗜铁素合成能力方面有很好的潜力。
在磷酸盐利用能力方面，以有机磷为磷源的植酸钙液体培养基中菌株Q2 处理的可溶性磷含量与菌株P8 和P7 处理相差不大，而以无机磷为磷源的NBRIP 液体培养基中菌株Q2 处理的可溶性磷含量在培养7～9 d 内持续增加，含量明显高于P8 和P7 处理。但该试验对菌株溶磷能力的探讨并没有随培养时间记录各菌株发酵液的pH 值，而微生物解磷机制十分复杂，主要是有机酸、植酸酶以及磷酸酯酶的作用降低pH，提高对磷的利用，增加有效磷的含量[23]，因此，在后续研究中将进一步探讨pH 值的变化及影响机制。
在纤维素酶活性测定的试验中，Q2 的纤维素酶活性为5.22 U/mL，在3 株菌中最高，而菌株Q2 产酶的最适条件仍需进一步研究，纤维素酶需要底物诱导才能产生，且容易被菌株利用的碳源反而会抑制纤维素酶合成，如经产酶条件优化的青霉属W-B23 的纤维素酶活性为3.79 U/mL，未经优化的纤维素酶活性为2.23 U/mL[18]。基于Q2 在纤维素酶活性方面的潜力，本研究中菌株Q2 的产酶最适条件有待进一步发掘与优化。
菌株Q2 经生理及生物学鉴定后确定为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，该菌是一种嗜温、好氧、能产生芽孢的杆状细菌，其生理特征多样，在自然界中分布广泛，极易分离培养，不仅对人畜无毒无害，不污染环境，还能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌的强定植能力和适应能力使其在营养获取、物理位点和生态位点有巨大的竞争优势[24]。枯草芽孢杆的营养需求简单，生长繁殖较快。因此，以枯草芽孢杆菌为菌种的菌剂加工简便，且活菌数高[25]。研究发现：枯草芽孢杆菌还能利用不具备致病性或致病能力弱的病原物来诱导植物产生抗性[26]。目前对生防菌的研究主要集中于实验室，由于菌株对不同环境的适应能力有差异，其实际促生抗病效果还需要经过盆栽试验和大田试验验证。基于菌株Q2 在目前试验阶段的抑菌效果和促生长指标，该菌有一定的研究价值，可对其抑菌功能及相关机理进一步展开试验分析。
经广谱抑菌试验及抑菌活性指标测定，菌株Q2 在抑菌促生长方面表现最佳；
经生理及生物学鉴定后确定Q2 为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌的嗜铁素、溶磷和纤维素酶活性高，具有进一步开发为抗病促生长生物菌剂的潜力。
