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阿热依·巴哈提，王均琪，祝娜，白颖璐，曹靖宜，张明烁，张严，李志勇，3，黄秀兰
(1.中央民族大学药学院，北京 100081；
2.中央民族大学生命环境与科学学院，北京 100081；
3.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)
随着新型冠状病毒肺炎(Corona virus disease，COVID-19)在全球的蔓延，及其对全球健康的潜在影响，寻找有效的治疗方案成为当务之急。由于开发一-种新的抗病毒药物需要数年才能投入临床应用，许多研究人员正在探索已知抗病毒药物对COVID-19的影响。因此，重新利用现有的抗病毒药物是加快药物审批进程的一种实用方法。法匹拉韦(favipiravir，T-705)是一种广谱抗病毒嘌呤核酸类似物药物，针对多种RNA病毒(流感病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、黄病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒和甲型病毒等)进行开发治疗，通过抑制RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)发挥作用，并可能在抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(syndrome coronavirus type 2，SARS-CoV-2)的治疗中作为一种主要药物[1-2]。该药在日本被批准用于治疗新发流感，且由于其强大的抗病毒作用在2020年被中国批准用于治疗COVID-19[3]。虽然目前有文献研究表明，法匹拉韦通过抑制SARS-CoV-2-RdRp、SARS-CoV-2-3CLpro或者其他靶标来治疗COVID-19，但其作用机制仍不明确。
分子对接最早于20世纪80年代中期至20世纪90年代初被开发用于预测已知活性化合物的结合模式，并虚拟筛选大型数字化合物库，以降低成本并加快药物发现。分子对接在当前药物发现中的应用较多，如用于配体-靶标结合合理化、虚拟筛选、靶标捕获和分析、非靶标预测、多药药理学、药物重新定位等[4]。此外，分子对接是计算机辅助药物设计(computer aided drug design，CADD)的关键组成部分。CADD使用计算机功能、三维图形、数学和统计数据来理解和预测具有潜在靶标的小分子抑制剂的结合模式和能量。根据其受体特征，通过受体与药物分子之间的相互作用方式来预测其结合模式和亲和力的一种方法，其结合分数越低，说明亲和力越高[5-6]。笔者在本文通过结合法匹拉韦和COVID-19靶点分子对接分数，系统回顾法匹拉韦通过与COVID-19靶点相互作用对抗COVID-19的作用机制，以期为治疗COVID-19的临床实践提供有力证据。
针对SARS-CoV-2结构特征进行的各种研究有助于确定药物治疗的主要靶标。SARS-CoV-2是一种正向RNA病毒，基因组大小为29.9 kb，除了5"UTR之外，基因组的三分之二由部分重叠的11个开放阅读框(open reading frame，ORF)组成(图1)。ORF(Orf1a和Orf1b)编码两个多聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab在3个不同的N端位点被PLpro裂解，在11个不同位点被PLpro裂解，释放出非结构蛋白(nonstructural protein，NSPs)。其中几个NSPs是自然界中的酶，有SARS-CoV-2关键酶，即3CLpro(NSP5)、RdRp(NSP12)和PLpro(NSP3)[8](图2)。其余三分之一基因组3′端编码辅助蛋白[尖峰(S)、包膜(M)、包膜(E)和结构蛋白[核衣壳蛋白(N))]。SARS-CoV-2病毒是一个巨大的多形性球形颗粒，其主要由S、E、M、N蛋白和基因组(+SS RNA)组成。N蛋白呈螺旋状弯曲与+SS RNA结合，而S蛋白、E蛋白和M蛋白与病毒包膜结合，S蛋白在病毒进入细胞时发挥识别作用[9]。
图1 ORF编码的NSPs(NSP1-NSP16)[7]
图2 SARS-CoV-2形态及关键酶机制图[7]
1.1SARS-CoV-2-RdRp SARS-CoV-2复制复合物主要由病毒NSPs的多亚基转录复合物组成，核心成分主要是RdRp(NSP12)，而NSP12的功能发挥也需要NSP7和NSP8两个辅因子参与，它们的加入将促进NSP12与RNA模板结合。在SARS-CoV，NSP12充当与NSP7和NSP8的三重聚合酶复合物。NSP7和NSP8激活NSP12的RNA合成活性并赋予其合成能力。该三重聚合酶复合物进一步与NSP14结合，赋予校对核酸外切酶功能。值得注意的是，SARS-CoV和SARS-CoV-2的RdRp具有96%序列相似性[10]。故鉴于RdRp在病毒基因组复制和转录中的关键作用，它成为抗病毒药物如法匹拉韦治疗COVID-19的作用靶标[11-12]。
1.2SARS-CoV-2-3CLpro此外，在SARS-CoV-2中已经鉴定出两种主要蛋白酶，即3CLpro(NSP5)和PLpro(NSP3)。3CLpro也称为主要蛋白酶(Mpro)，是帮助在SARS-CoV-2中切割复制酶多蛋白1ab的两种关键蛋白水解酶之一，在病毒成熟步骤中起着至关重要的作用。其长306个氨基酸，从病毒RNA基因组的Orf1ab翻译而来。已知3CLpro可在11个特定位点切割复制酶多蛋白，识别位点为Leu-Gln↓(Ser，Ala，Gly)。3CLpro会自动从多聚蛋白裂解，首先产生成熟蛋白。然后3CLpro裂解pp1a和pp1ab下游NSP，导致释放12个NSPs(NSP4，NSP6-16)，它们对病毒复制和病毒组装至关重要。3CLpro促进病毒生物合成，故推测抑制3CLpro会阻断病毒复制、转录和扩增[13-14]。因此3CLpro是COVID-19重要药物靶标。
1.3SARS-CoV-2-PLpro木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLpro)是另一种蛋白水解酶，有助于加工复制酶多蛋白。已知PLpro会在3个位点切割复制酶多蛋白，释放出NSP1、NSP2和NSP3，这对于病毒复制必不可少。PLpro裂解NSP1、NSP2和NSP3，3CLpro处理剩余的13种NSPs。NSPs产生后，在宿主膜上组装病毒复制酶复合体，启动病毒基因组复制和转录。除了其蛋白水解功能外，据报道PLpro还具有去泛素化性质[10，15]。它通过关闭关键途径在抵抗宿主对病毒感染的免疫反应强度中也起着中心作用。
2.1法匹拉韦的应用及发展 法匹拉韦又名T-705，在细胞内进行核糖基化和磷酸化形成活性代谢物，即法匹拉韦-呋喃核糖基-5-三磷酸(法匹拉韦-RTP)，结构见图3，并可能作为核苷酸类似物起作用，选择性抑制病毒依赖性RNA聚合酶，或在掺入病毒RNA时引起致死性诱变。而对哺乳动物细胞无细胞毒性[17]。除了流感病毒以外，法匹拉韦在体外和体内对其他分段的RNA病毒也显示出有效的抗病毒活性。因此，法匹拉韦可能对SARS-CoV-2具有潜在抗病毒作用[16，18]。
图3 法匹拉韦的化学结构[16]
法匹拉韦于2002年被开发作为流感病毒复制的抑制剂，并于2014年被日本批准作为新出现或再次出现的流感病毒的治疗方案[19]。然而，仅当政府判定法匹拉韦将用作对抗新型或重新出现的流感病毒的对策时，才考虑将其用于患者给药。此外，法匹拉韦在2014年被成功用于埃博拉病毒感染患者的暴露后预防和治疗。中国台湾疾病预防控制中心决定在2015年为感染包括禽流感和猪流感在内的新流感病毒株的人储备法匹拉韦。日本政府决定在2017年储存法匹拉韦，作为200万人的新型流感对策[16]。2020年发现，法匹拉韦作为一种前药，可以有效抑制Vero E6细胞(ATCC-1586)中的SARS-CoV-2感染[20]。2020年3月，国家药品监督管理局宣布立即批准法匹拉韦片(规格：0.2 g)用于成人COVID-19患者的临床试验，因为据观察，法匹拉韦总体疗效和安全性良好，不良反应最小[16，21]。
2.2法匹拉韦抑制SARS-CoV-2的作用机制 SARS-CoV-2以S蛋白与血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)等受体结合开始其生命周期(图4)。结合后S蛋白构象变化支持病毒膜与细胞膜融合(受体介导的内吞)进入宿主细胞。它触发了SARS-CoV-2向细胞质释放RNA。病毒基因组RNA在细胞质显露出来，正单链基因组被转录以产生病毒蛋白酶PLpro和3CLpro，它们将RNA的1a和1b之间的框移(-1)导致产生的两个多聚蛋白(pp1a和pp1ab)切割成16种成熟的NSPs，包括两种复制酶多蛋白[RdRp和解旋酶(Hel)]。成熟的NSPs和RdRp及Hel蛋白聚集成复制-转录复合物，用于病毒复制和转录。RTCs合成负链导向RNA (gRNA)和一组用于病毒复制和转录的亚基因组RNA。新产生的亚基因组RNA被翻译成病毒结构蛋白，如S、M和E蛋白。这些蛋白被插入粗面内质网膜中，然后被转运到ER-高尔基中间室(ener)，与N蛋白包被的RNA组装形成病毒颗粒。然后病毒粒通过胞吐作用从细胞释放出来[22-24]。法匹拉韦可以选择性抑制SARS-CoV-2的RdRp基因并阻断基因组RNA复制。SARS-CoV-2RdRps之间显著的高度结构保守性强烈表明，当需要快速反应时，通过对关键病毒酶的可用抑制剂进行改进，从而使得它们作为治疗药物。此外，法匹拉韦还可以通过结合如SARS-CoV-3CLpro和SARS-CoV-PLpro等COVID-19靶标来治疗COVID-19，笔者在本文综述法匹拉韦通过不同靶点抑制COVID-19分子对接的文章(表1)。
图4 法匹拉韦抑制SARS-CoV-2的作用机制[16]
表1 法匹拉韦与SARS-CoV-2各靶点的分子对接
续表1 法匹拉韦与SARS-CoV-2各靶点的分子对接
2.2.1法匹拉韦通过抑制SARS-CoV-2-RdRp抗COVID-19 法匹拉韦(原药)是嘌呤碱基类似物，通过细胞内磷酸核糖化作用转化为活性代谢物法匹拉韦-RTP(图5)。后者是RdRp选择性和有效抑制剂。法匹拉韦通过容易出错的病毒RdRp结合到新生病毒RNA，导致对SARS-CoV-2复制和转录抑制[35]。存在于各种类型核糖核酸病毒中的RdRp使法匹拉韦具有更广泛的抗病毒活性。在RNA病毒掺入后，法匹拉韦-RTP作为诱变剂，能够逃离SARS-CoV-2修复机制。法匹拉韦-RTP处理减少了SARS-CoV-2基因组中已经具有低胞嘧啶(约17.6%)的CoV核苷酸含量。总之，随着突变频率增加，法匹拉韦-RTP通过病毒所致细胞病变效应，减少了病毒RNA和感染性颗粒数量，对SARS-CoV-2产生了积极作用[36]。此外，法匹拉韦与RdRp有较强结合亲和力，如表1所示，对接得到结合能为-5.0～-4.8 kcal·mol-1[25-26]。然而，HAGAR等[27]认为，PDB结构不适合分子对接研究，因此通过从PDB结构中去除水分子和配体修饰了法匹拉韦结构，制备了法匹拉韦类似物(PubChem CID：89869520)，法匹拉韦结构修饰类似物的对接结果显示出与RdRp靶标的良好相互作用。法匹拉韦类似物与SARS-CoV-2的RdRp(6M71-A)结合亲和力为-21.3 kJ·mol-1，该值较法匹拉韦结合亲和力更小。因此，该药物结构修饰物更适于用作针对选定靶标的抑制剂。GE等[21]进行分子对接，结果显示，法匹拉韦-22.3 kJ·mol-1，法匹拉韦三磷酸-37.4 kJ·mol-1，根据分子对接结果，法匹拉韦三磷酸盐活性代谢物形式较法匹拉韦前药和其他中间代谢物表现出更高的相互作用。
图5 法匹拉韦的活化过程
2.2.2法匹拉韦通过抑制SARS-CoV-2-3CLpro抗COVID-19 SARS-CoV-2-3CL是最有吸引力的抗病毒药物靶点之一，因为病毒成熟几乎完全依赖于3CLpro活动。例如，12种Nsps的成熟，包括RdRp和Nsp13等关键蛋白，需要通过3CLpro进行解理。多项研究结果表明，抑制3CLpro可以防止病毒复制[34，37]。因此，3CLpro被认为是SARS-CoV-2的致命弱点，可作为有效的抗病毒药物靶点。此外，3CLpro抑制剂可能在不同器官不同细胞类型中灭活病毒，而独立于病毒进入所需的各种受体/宿主蛋白酶(在细胞膜上)。
法匹拉韦可以作为RdRp和3CLpro的潜在抑制剂，且调研结果显示，法匹拉韦与3CLpro的结合能力较法匹拉韦与RdRp结合更好，其原因可能是使用的分子对接软件不一致或者使用的配体不一致。研究人员对法匹拉韦和SARS-CoV-2-3CLpro进行分子对接，结果见表1。法匹拉韦和3CLpro的结合能范围为(-38.6～-17.6)kJ·mol-1[26，28-32]。此外，KUMAR等[29]采用SARS-CoV-2-3CLpro作为靶标，得到的结合能为-153.91 kJ·mol-1。其中HAGAR等[27]进行了3CLpro(PDB ID：6LU7)和法匹拉韦对接模拟研究，发现其结合能仅为-17.0 kJ·mol-1，其原因有可能为法匹拉韦不位于受体的催化二分体中，故可知法匹拉韦与3CLpro无显著结合。对此，SHIN等[33]研究了7种他汀类药物、标准配体和蛋白酶抑制剂与COVID-193CLpro的亲和力。当他汀类药物与已知抗3CLpro抑制剂一起停靠时，具有很强药物样性质。6LU7对接位点与标准配体法匹拉韦相互作用的结合能为-24.2 kJ·mol-1。因此，法匹拉韦可以联合他汀类药物共同充当SARS-CoV-2-3CLpro和SARS-CoV-2的潜在抑制剂。
2.2.3法匹拉韦通过抑制SARS-CoV-2-PLpro抗COVID-19 PLpro是一种基本的冠状病毒酶，为处理病毒多蛋白必需，以产生功能性复制酶复合物并促成病毒传播。PLpro还涉及切割宿主蛋白质的翻译后修饰蛋白，作为对抗宿主抗病毒免疫反应的规避机制。SARS-CoV-2-PLpro优先切割泛素样干扰素刺激的基因15蛋白(ISG15)，而SARS-CoV-PLpro主要针对泛素链。SARS-CoV-2-PLpro易于从干扰素反应因子3中解出基因15蛋白，并减弱I型干扰素反应，故其抑制剂可有效去除ISG15和泛素修饰，此外，相关抑制剂GRL-0617可以抑制SARS-CoV-2-PLpro会损害病毒诱导的细胞致病效应，保持抗病毒干扰素通路，并减少病毒在受感染细胞中的复制，从而减轻炎症和抗病毒信号传递[14，37-39]。研究人员对法匹拉韦与PLpro进行分子对接，如表1所示，二者结合能估计为-19.6～-23.8 kJ·mol-1[27，30]。这些结果凸显了一种潜在的双重治疗策略，其中靶向SARS-CoV-2-PLpro可以抑制SARS-CoV-2感染并促进抗病毒免疫。
SARS-CoV-2的3种病毒NSPs，即蛋白酶3CLpro、PLpro和RdRp在SARS-CoV-2复制中发挥关键作用，因此法匹拉韦可结合上述病毒靶标从而抑制SARS-CoV-2感染。根据其上述相关分子对接分数可知，法匹拉韦和上述SARS-CoV-2靶标结合的亲和力较高，法匹拉韦可以通过以上靶标抑制COVID-19。此外，法匹拉韦作为一个原药，和靶标的分子结合能力较弱，故可以对其进行结构修饰或者和其他药物联用，以实现双重治疗策略，抑制SARS-CoV-2感染的同时促进抗病毒免疫。
法匹拉韦的主要优势为口服给药，并且可以用于有症状但无需住院的患者。由于大多数(85%)COVID-19患者患有轻中度疾病，可以在家接受治疗，因此该药可能会用于大量患者。其在缩短病毒脱落持续时间方面的作用也可能产生流行病学影响，因为其可减少病毒在家庭和社区中的传播[40]。
法匹拉韦具有较好的临床结果。DOI等[41]在中国进行的前瞻性开放标签多中心试验，以比较临床确诊的SARS-CoV-2管理中的两种治疗手段，对于中度COVID-19患者和高血压和(或)糖尿病的COVID-19患者，法匹拉韦组退热和止咳潜伏期明显短于阿比多尔组(均P<0.01)。MISHIMA等[42]进行的一项开放标签对照研究，以评估法匹拉韦对COVID-19的临床疗效。法匹拉韦与更快的病毒清除率和更高的胸部成像改善率有关，且与洛匹那韦/利托那韦相比，法匹拉韦在疾病进展和病毒清除方面对SARS-CoV-2的治疗效果明显更好。此外，法匹拉韦与其他药物联合治疗中，法匹拉韦起到了积极影响，甲磺酸纳法莫司他联合法匹拉韦治疗可能允许阻止病毒的进入和复制，并抑制致病宿主反应，即高凝血病[43]。
目前，法匹拉韦可能是治疗COVID-19相对有效的药物，然而，上述研究数据表明法匹拉韦的疗效需要等待更多临床有效证据来确认其对SARS-CoV-2治疗的价值。此外，应注意该药的不良反应。口服法匹拉韦后值得注意的不良反应包括高尿酸血症、致畸、可能性肝损伤和发热。因此，如果女性确认或怀疑怀孕，应避免服用法匹拉韦[44]。
总之，法匹拉韦可能成为治疗轻度至中度症状SARS-CoV-2感染的一种有效药物，但需要更多临床试验验证。
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